作者：田晶    作者單位：吉林醫藥學院生理學教研室，吉林 吉林 132013

 

【摘要】  膜片鉗技術是研究離子通道的“金標準”，應用該技術可以證實細胞膜上離子通道的存在，并能對其電生理特性、分子結構、藥物作用機制等進行深入的研究。

 

【關鍵詞】  膜片鉗技術 離子通道 進展

    1976年由德國馬普生物物理化學研究所的Neher和Sakamann首次報道了應用膜片鉗技術在蛙胸皮肌細胞膜上記錄到單通道電流^［1］。在以后的5 年中，膜片鉗技術不斷完善。自1981年以來，該技術已經在不同動物的肝、脾、胃腸、心肌、骨骼肌、神經系統、內分泌等各類細胞上應用并取得了研究成果^［2］。膜片鉗技術點燃了細胞和分子水平的生理學研究的革命之火，與基因克隆技術(gene cloning)并駕齊驅，給生命科學研究帶來了巨大的前進動力。

 

    1  膜片鉗術的原理

 

      膜片鉗技術是用微玻管電極（尖端直徑約1～5 μm）接觸細胞膜而不刺入，然后在微電極另一端開口施加適當的負壓，將與電極尖端接觸的那一小片膜輕度吸人電極尖端的纖細開口，這樣在這小片膜周邊與微電極開口處的玻璃邊沿之間，會形成緊密的封接（gigaohm seal），在理想的情況下其電阻可達數個或數十個千兆歐姆(l09Ω)以上的阻抗封接，使與電極尖開口處相連的細胞膜的小區域（膜片）與其周圍的細胞膜 在電學上完全分隔，如果在這一小片膜中只包含了一個或少數幾個通道蛋白質分子，那么通過此微電極就可測出單一通道開放時的離子電流和電導，并能對單通道的其他功能特性進行分析。

 

    2   膜片鉗主要技術操作

 

    2.1   實驗所需儀器

 

    隨著計算機軟硬件技術的發展，出現了容數據記錄、采集、處理功能于一身的硬件軟件系統，簡化了膜片鉗技術的操作及分析。實驗儀器包括膜片鉗放大器，信號采集器，三維液壓操縱器，顯微鏡，給藥系統，細胞動態呈像及攝像系統等。

 

    2.2  實驗標本制備

 

    膜片鉗實驗采用的標本可以是培養的細胞，也可以是急性分離的細胞。因為細胞分離技術簡單、快速、實用，分離出的細胞可以基本滿足實驗的要求，所以多用后者。不同實驗室已經用從大鼠、豚鼠、兔、狗、豬、羊、雪貂等動物制作的細胞標本進行了大量的研究。近年也有學者在神經細胞實驗中用振動切片將組織制成超薄 片作為標本，這樣能保持神經細胞在體發育的程序及空間結構，有相對完整的突觸聯系。此外神經元沒有受到消化酶的破壞，細胞生物活性接近生理狀態。而且，現在出現了雙探頭膜片鉗放大器可以做雙細胞記錄，觀察細胞間通道的動態聯系^［3］。

 

    2.3  實驗的一般操作步驟

 

    ①拉制微電極和充灌微電極；②將預先處理的實驗標本置于顯微鏡載物臺上的灌流槽內；③于顯微鏡低倍鏡下，用微操縱器將電極移動到浴液上方，換用高倍鏡按一 定標準選擇合適的細胞，然后接近靶細胞或組織，完成電極與標本的封接；④給予鉗位電壓或電流等指令條件并分別記錄電流、電壓等參數；⑤對電流等性質分析后，施加不同的藥物記錄并分析電流等參數。

 

    2.4  實驗數據的記錄與分析

 

    膜片鉗實驗記錄的離子通道電流是一連串近似矩形的脈沖信號。在通道開放期間，信號的形態復雜多樣，有時是多個矩形波單位幅值簇狀發放（burst），有時 有短暫的間隔，時而有簇狀串（cluster）等，表示離子穿越通道的過程并非全部線性連續而富含非線性過程。通道的開放時程是隨機變化的指數形式分布。用指數和的分布，求取平均開放時間才能更精確地描述通道的活動，往往需要成百上千個通道電流數據，這樣龐大的分析工作必須借助于計算機完成。

 

3  膜片鉗實驗的常用工作模式

 

    3.1  細胞吸附式膜片

    細胞吸附式膜片（cell attached patch） 是膜片鉗的基本方式，其它方式由此衍生。這種膜片形式比較穩定，因細胞骨架及有關代謝過程是完整的，故對細胞結構和環境干擾最小。但這種膜片形式易在電極尖端形成囊泡，從而細胞骨架可能有所變化。另外這種膜片不能控制細胞內成分。且任何影響膜電位的處理均可影響其電位水平。

 

    3.2  內面向外式膜片

 

    內面向外式膜片（inside out patch）細胞內外和電極內的溶液均可調控，既能較容易地改變細胞內的離子或物質濃度，又能把酶等直接加于膜的內側面，適宜研究胞內物質對通道活動的影響。但實驗中難以改變膜外側物質，且需浸于低鈣液中。常用于研究依賴細胞內鈣的離子通道，如鈣敏感的鉀通道，還可用于細胞內激素和第二信使與通道的調節作用。

 

    3.3  外面向外式膜片

 

    外面向外式膜片（outside out patch） 能接觸膜的兩側，可以任意改變膜外物質的濃度，有利于研究離子、遞質對膜外表面的作用，多用于研究細胞膜外側受體控制的離子通道。這些受體直接作用于離子通道，而不需經過第二信使系統。因細胞外液容易更換，故加藥方便。缺陷是實驗中難以改變胞內成分，而且電極管內必須充以低鈣液。

 

    3.4  全細胞式膜片

 

    全細胞式膜片（whole cell patch）方式使細胞內與浴槽之間的漏流極少。電極本身阻抗（1～ 10 MΩ）與細胞封接后的阻抗相比較低，這種低接觸阻抗使單管電壓鉗容易實現。電極管內與細胞之間彌散交換與平衡快，因而容易控制細胞內液的成分。細胞鉗記錄的是許多通道的平均電流，有利于綜合分析。如果有目的地將膜電位鉗制在某一程度，可做到選擇性抑制某些通道的活性而只記錄某種通道電流的總和，并可在同一 細胞上觀察幾種不同通道的情況。通過改變內部介質，如改變電極液成分，或在電極液中加入所需藥物，通過滲透很快改變胞漿成分并達到平衡，該手段在全細胞記錄中廣泛應用。它適合于小細胞的電壓鉗位，對于直徑大于30 μm的細胞很難實現鉗位。不足之處是由于電極與細胞間交換快，細胞內環境很容易破壞，因此記錄所用的電極液應與胞漿主要成分相同，如高K⁺，低Na⁺ 和Ca ²⁺及一定的緩沖成分和能量代謝所需的物質。

 

    3.5  穿孔膜片

    穿孔膜片 (perforated patch)  是為克服常規全細胞模式的胞質滲漏問題，有學者將與離子親和的制霉菌素或二性霉素B經微電極灌流到含有類甾醇的細胞膜上，形成只允許一價離子通過的孔，用此法在膜片上做很多導電性孔道，借此對全細胞膜電流進行記錄。由于此模式的胞質滲漏極為緩慢，局部串聯阻抗較常規全細胞模式高，所以鉗制速度很慢，也稱為 緩慢全細胞模式。

 

    4  膜片鉗技術的主要用途

 

    膜片鉗技術廣泛用于研究細胞離子通道，已經成為研究細胞水平生理功能的常用技術。歸納其主要用途包括^［4］ ：1）可分辨單通道電流，直接觀察通道開啟和關 閉的全過程。通過測得的單通道特征參數可鑒別通道類型，同時可驗證和研究通道的開關動力學模型。2）單通道記錄可以解釋某些藥物的作用機制，以研究特定藥 物對電壓和遞質依賴通道的影響。3）膜片鉗的空間分辨率高，在中樞神經系統中可分離細胞體與軸突和樹突的電流；在周圍神經系統中可深入了解受體的分布區域，繪制細胞表面的特定離子通道的分布圖。4）“內面向外”和“外面向內”膜片記錄允許任意改變膜片內外溶液成分，分別研究單一組分對通道特征的影響，避免了其他成分的干擾。而全膜片記錄可用來研究常規電壓鉗無法研究的小型細胞，在控制細胞內一定離子濃度的同時監測整個細胞膜的電活動。這種方法已被用于采 用重組DNA技術表達的通道研究。5）膜片鉗技術還可用于研究第二信使的作用。

 

5  膜片鉗技術的擴展應用與展望

 

    膜片鉗技術與其它技術相結合，使其應用不斷擴展。1991年Eberwine和Yeh 等首先將膜片鉗技術與PCR 技術結合起來運用，其具體方法是：用全細胞膜片鉗記錄培養細胞或制備腦片的生物物理學和藥理學特征，然后將細胞胞漿內容物收集入膜片微吸管尖內，再把胞漿 RAN反轉錄成cDNA，然后用PCR直接擴增，PCR的產物通過凝膠電泳和DNA序列進行分析。這兩項技術的結合可對形態相似、而電活動不同的細胞做出分子水平的解釋^［5］ 。這樣在觀察電生理功能的同時，分析有關基因表達改變的情況，成功地實現了在單個細胞內同時研究功能與分子的變化。

 

    通過克隆通道基因轉染靶細胞的方法，已能進行通道分類并將與人類有關的通道基因克隆表達，如對KATP異源同構的研究；并用膜片鉗記錄通道的動力學特性， 增加了對通道結構與功能的認識，例如發現病理和非病理狀態下，因通道基因表達的不同而有不同的電生理學特性。分子生物學的發現認為通道的基因表達處于變化之中，不同狀態（如發育，疾病）會帶來相應的電變化或電重塑^［6］ 。

 

    膜片鉗技術結合Indo��1、Fluro��2和Fluro��3等熒光探針法測定胞內鈣濃度，可研究鈣內流和胞內鈣釋放的情況。用放射配體氚即3H結合技術 與膜片鉗技術結合，可以檢測異丙酚與通道的結合位點^［7］ 。另外，Nygren等^［8］ 和Priebe等^［9］ 用膜片鉗實驗結合數學模型的方法描述人心房 和心室肌細胞通道特性，并可對特殊狀態下心肌的通道變化做出預測。

 

    總之膜片鉗技術以其實用、快速、靈敏、準確及重復性好等技術優勢已經在大量的研究中得到證實。膜片鉗技術為從分子水平了解生物膜離子通道的門控動力學特征及通透性、選擇性等膜信息，提供了最直接的手段，使人們對細胞膜通道功能的認識進入了一個嶄新的階段。膜片鉗技術與其它技術結合必將繼續為生命科學的發展 做出巨大貢獻。

 

【參考文獻】

［1］ Neher E,Sakmann B.Single�瞔hannel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres［J］.Nature，1976，260(5554):799��802.

 

［2］ Korneich B G.The patch clamp technique:principles and technical considerations［J］.J Vet Cardiol，2007，9(1):25��37.

 

［3］ Yamazaki Y,Kato H.Modulatory effects of peri�瞚nterneuronal glial cells on neuronal activities［J］.Brain Nerve，2007，59(7):689��695.

 

［4］ 馬力農.細胞膜離子通道及其檢測技術的研究進展［J］.深圳職業技術學院學報，2003，2（3）：21��26.

 

［5］ 賴仞，查宏光，張云.動物離子通道毒素與藥物開發［J］.動物學研究，2000，21（6）：499��506.

 

［6］ 黃兵，陳雷.膜片鉗技術在心肌細胞藥理效應研究中的應用［J］.中國藥學雜志，2002，379（6）：406��409.

 

［7］ Zhou W G,Fontenot J,Liu S,et al.Modulation of cardiac calcium channels by propofol［J］.Anesthesiology，1997，86 (3):670��675.

 

［8］ Nygren A,Fiset C,Firek L,et al.Mathematical model of an adult human atrial cell:the role of K+ currents in repolarization［J］.Circ Res,1998，82(1):63��81.

 

［9］ Priebe L,Beuckelmann D J.Simulation study of cellular electric properties in heart failure［J］.Circ Res,1998，82(11):1206��1223.