一、細(xì)菌的簡單染色法
  1 目的
  1.1 學(xué)習(xí)微生物涂片、染色的基本技術(shù)。
  1.2 掌握細(xì)菌的簡單染色法。
  1.3 初步認(rèn)識細(xì)菌的形態(tài)特征，鞏固學(xué)習(xí)油鏡的使用方法和無菌操作技術(shù)。
  2 原理
  細(xì)菌的涂片和染色是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的一項(xiàng)基本技術(shù)。細(xì)菌的細(xì)胞小而透明，在普通的光學(xué)顯微鏡下不易識別，必須對它們進(jìn)行染色。利用單一染料對細(xì)菌進(jìn)行染色，使經(jīng)染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。此法操作簡便，適用于菌體一般形狀和細(xì)菌排列的觀察。
  常用堿性染料進(jìn)行簡單染色，這是因?yàn)樵谥行�、堿性或弱酸性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷，而堿性染料在電離時(shí)，其分子的染色部分帶正電荷，因此堿性染料的染色部分很容易與細(xì)菌結(jié)合使細(xì)菌著色。經(jīng)染色后的細(xì)菌細(xì)胞與背景形成鮮明的對比，在顯微鏡下更易于識別。常用作簡單染色的染料有美藍(lán)、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅等。

  當(dāng)細(xì)菌分解糖類產(chǎn)酸使培養(yǎng)基pH下降時(shí)，細(xì)菌所帶正電荷增加，此時(shí)可用伊紅、酸性復(fù)紅或剛果紅等酸性染料染色。
  染色前必須固定細(xì)菌。其目的有二：一是殺死細(xì)菌并使菌體粘附于玻片上；二是增加其對染料的親和力。常用的有加熱和化學(xué)固定兩種方法。固定時(shí)盡量維持細(xì)胞原有的形態(tài)。
  3 材料
  3.1  菌種
  枯草芽孢桿菌12～18h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物、金黃色葡萄球菌約24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物、大腸桿菌24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物、面包酵母瓊脂斜面培養(yǎng)物。
  3．2  染色劑
  呂氏堿性美藍(lán)染液(或草酸銨結(jié)晶紫染液)，石炭酸復(fù)紅染液。
  3.3  儀器或其他用具
  顯微鏡，酒精燈，載玻片，接種環(huán)，玻片擱架、雙層瓶(內(nèi)裝香柏油和二甲苯)，擦鏡紙，生理鹽水或蒸餾水等。
  4 流程
  涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→鏡檢。
  5 步驟
  5.1  涂片
  取兩塊潔凈無油的載玻片，在無菌的條件下各滴一小滴生理鹽水(或蒸溜水)于玻片中央，用接種環(huán)以無菌操作，分別從枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌和大腸桿菌斜面上挑取少許菌苔于水滴中，混勻并涂成薄膜。若用菌懸液(或液體培養(yǎng)物)涂片，可用接種環(huán)挑取2～3環(huán)直接涂于載玻片上。注意滴生理鹽水（蒸餾水）和取菌時(shí)不宜過多且涂抹要均勻，不宜過厚。

  5.2  干燥
  室溫自然干燥。也可以將涂面朝上在酒精燈上方稍微加熱，使其干燥。但切勿離火焰太近，因溫度太高會(huì)破壞菌體形態(tài)。
  5.3  固定
  如用加熱干燥，固定與干燥合為一步，方法同干燥。  涂片、干燥和熱固定。
  5.4  染色
  將玻片平放于玻片擱架上，滴加染液1～2滴于涂片上(染液剛好覆蓋涂片薄膜為宜)。呂氏堿性美藍(lán)染色1～2min，石炭酸復(fù)紅(或草酸銨結(jié)晶紫)染色約1min 。
  5.5  水洗
  傾去染液，用自來水從載玻片一端輕輕沖洗，直至從涂片上流下的水無色為止。水洗時(shí)，不要水流直接沖洗涂面。水流不宜過急、過大，以免涂片薄膜脫落。
  5.6  干燥
  甩去玻片上的水珠自然干燥、電吹風(fēng)吹干或用吸水紙吸干均可以（注意勿擦去菌體）。
  5.7  鏡檢
  涂片干后鏡檢。涂片必須完全干燥后才能用油鏡觀察。
  6 結(jié)果
  繪制單染色后觀察到的大腸桿菌和藤黃微球菌的形態(tài)圖。
  二、革蘭氏染色法
  1  目的
  1.1 了解革蘭氏染色法的原理及其在細(xì)菌分類鑒定中的重要性。
  1.2 學(xué)習(xí)掌握革蘭氏染色技術(shù)，鞏固學(xué)習(xí)光學(xué)顯微鏡油鏡的使用方法。

2  原理
  革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學(xué)家Christain
  Gram氏創(chuàng)立的，革蘭氏染色法可將所有的細(xì)菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-）兩大類。革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中最重要的鑒別染色法。
  革蘭氏染色法的基本步驟是：先用初染劑結(jié)晶紫進(jìn)行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脫色，最后用復(fù)染劑(如番紅)復(fù)染。經(jīng)此方法染色后，細(xì)胞保留初染劑藍(lán)紫色的細(xì)菌為革蘭氏陽性菌；如果細(xì)胞中初染劑被脫色劑洗脫而使細(xì)菌染上復(fù)染劑的顏色(紅色)，該菌屬于革蘭氏陰性菌。

  革蘭氏染色法所以能將細(xì)菌分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性，是由這兩類細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同決定的。實(shí)際上，當(dāng)用結(jié)晶紫初染后，像簡單染色法一樣，所有細(xì)菌都被染成初染劑的藍(lán)紫色。碘作為媒染劑，它能與結(jié)晶紫結(jié)合成結(jié)晶紫一碘的復(fù)合物，從而增強(qiáng)了染料與細(xì)菌的結(jié)合力。當(dāng)用脫色劑處理時(shí)，兩類細(xì)菌的脫色效果是不同的。革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，壁厚、類脂質(zhì)含量低，用乙醇(或丙酮)脫色時(shí)細(xì)胞壁脫水、使肽聚糖層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑縮小，透性降低，從而使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物不易被洗脫而保留在細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)脫色和復(fù)染后仍保留初染劑的藍(lán)紫色。革蘭氏陰性菌則不同，由于其細(xì)胞壁肽聚糖層較薄、類脂含量高，所以當(dāng)脫色處理時(shí)，類脂質(zhì)被乙醇(或丙酮)溶解，細(xì)胞壁透性增大，使結(jié)晶紫-碘的復(fù)合物比較容易被洗脫出來，用復(fù)染劑復(fù)染后，細(xì)胞被染上復(fù)染劑的紅色。

  3  材料
  3.1  菌種
  大腸桿菌（Escherichia  coli）約24h營養(yǎng)瓊脂斜面菌種一支，枯草芽孢桿菌（Bacillus
  subtilis）約16h牛肉膏瓊脂斜面菌種一支。
  3.2  染色劑
  結(jié)晶紫染色液、盧戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸復(fù)紅液。
  3.3  儀器或其他用具
  顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、載玻片、酒精燈、蒸餾水、香柏油、二甲苯。
  4  流程
  涂片→干燥→固定→染色（初染→媒染→脫色→復(fù)染）→鏡檢。
  5  步驟
  5.1  涂片
  5.1.1  常規(guī)涂片法
  取一潔凈的載玻片，用特種筆在載玻片的左右兩側(cè)標(biāo)上菌號，并在兩端各滴一小滴蒸餾水，以無菌接種環(huán)分別挑取少量菌體涂片，干燥、固定。玻片要潔凈無油，否則菌液涂不開。

  5.2  初染
  滴加結(jié)晶紫(以剛好將菌膜覆蓋為宜)于兩個(gè)玻片的涂面上，染色1～2min ，傾去染色液，細(xì)水沖洗至洗出液為無色，將載玻片上水甩凈。
  5.3  媒染
  用盧戈氏碘液媒染約l min ，水洗。
  5.4  脫色
  用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色時(shí)，立即水洗，終止脫色，將載玻片上水甩凈。
  革蘭氏染色結(jié)果是否正確，乙醇脫色是革蘭氏染色操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。脫色不足，陰性菌被誤染成陽性菌，脫色過度，陽性菌被誤染成陰性菌。脫色時(shí)間一般約20～30s。
  5.5  復(fù)染
  在涂片上滴加番紅液復(fù)染約2～3min ，水洗，然后用吸水紙吸干。在染色的過程中，不可使染液干涸。
  5.6  鏡檢
  干燥后，用油鏡觀察。判斷兩種菌體染色反應(yīng)性。菌體被染成藍(lán)紫色的是革蘭氏陽性菌（G+），被染成紅色的為革蘭氏陰性菌（G-）。
  5.7  實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處理
  清潔顯微鏡。先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少許二甲苯擦去鏡頭上的殘留油跡，最后用擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗，涼干后備用。

  三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
  1 根據(jù)觀察結(jié)果，繪出兩種細(xì)菌的形態(tài)圖。
  2列表簡述兩株細(xì)菌的染色結(jié)果(菌的形狀、顏色和革蘭氏染色反應(yīng))。
  四、思考題
  1 哪些環(huán)節(jié)會(huì)影響革蘭色染色結(jié)果的正確性？其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是什么？
  2 進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，為什么特別強(qiáng)調(diào)菌齡不能太老，用老齡細(xì)菌染色會(huì)出現(xiàn)什么問題?
  3 革蘭氏染色時(shí)，初染前能加碘液嗎?乙醇脫色后復(fù)染之前，革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌應(yīng)分別是什么顏色?
  4 不經(jīng)過復(fù)染這一步，能否區(qū)別革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌？
  5 你認(rèn)為制備細(xì)菌染色標(biāo)本時(shí)，應(yīng)該注意哪些環(huán)節(jié)?
  6 為什么要求制片完全干燥后才能用油鏡觀察?
  7 如果涂片未經(jīng)熱固定，將會(huì)出現(xiàn)什么問題?加熱溫度過高、時(shí)間太長，又會(huì)怎樣呢?