前言

在鹽生環境中，Na⁺的毒性是降低植物生長能力的一個主要原因。在農業生產中經常使用幾種方法來減少Na⁺的毒性，使用復合物，例如石灰、石膏。在不同的植物中廣泛報道了增加Ca²⁺可以改善Na⁺的毒性。然而，在細胞水平Ca²⁺的調節機制并未完全得知。Ca²⁺和大量的胞內和胞外標記物發生相互作用而減少Na⁺的毒性。目前，SOS脅迫信號途徑是鹽脅迫下植物離子動態平衡的關鍵調節者。鹽脅迫激活了SOS3-SOS2蛋白激酶途徑從而引起了胞質Ca²⁺濃度的升高。這導致質膜Na⁺外流轉運體SOS1和通過質膜高親和轉運體HKT1的Na⁺內流，因此幫助細胞保持K⁺/Na⁺的動態平衡。胞液中Ca²⁺濃度上升的范圍依賴于胞外的Ca²⁺濃度，直接支持這個模型的實驗證據一直很缺乏。

增加胞外Ca²⁺濃度能夠通過CaM依賴的蛋白激酶刺激質膜H⁺-ATPase的活性。在鹽脅迫條件下，增加質膜H⁺-ATPase活性對于膜電壓的重新極化是必需的，從而保持膜的完整性和離子的動態平衡。通過SOS1 Na⁺-H⁺反向轉運體控制的Na⁺外流最終依賴于H⁺-ATPase的活性。擬南芥根內胚層質膜H⁺-ATPase活性的喪失導致對鹽的敏感性。SOS3-SOS2途徑的Ca²⁺刺激過Na⁺-H⁺反向轉運體促進液泡Na⁺的丟失。因此，Ca²⁺作為一個胞內調控者在鹽忍耐中起到重要作用。

Ca²⁺提供快速的保護作用，而細胞壁、膜脂和蛋白質提供長期的保護作用來抵御鹽脅迫。胞外Ca²⁺通過Na⁺內流抑制質膜滲透性非選擇陽離子通道（NSCCs）。使用多種電生理技術進行研究，例如：非損傷離子流測定技術、多種平行離子選擇電極技術、膜片鉗技術、膜電位測定。在根和葉片細胞中，胞外的Ca²⁺能夠通過質膜外表K⁺滲透通道直接抑制減少或者完全阻止Na⁺誘導的K⁺流失， 這是Ca²⁺通過K⁺通道改善Na⁺誘導的毒性的另一種關鍵過程。

本文重點介紹：如何準備適用于非損傷微測技術測定的植物組織樣品，如何進行測定，以及得到的結果。

材料和方法

1 植物材料

擬南芥：野生型（Columbia），akt1突變體

2 利用非損傷微測技術測定凈K⁺和Na⁺的流動

使用離子選擇振動微電極進行非損傷測量K⁺和Na⁺的凈流量。電極在使用前用一套標準溶液進行校正，0.1-1mM的K⁺，0.2-50mM的Na⁺。離子選擇電極放置于可控制三維運動的操縱器上，電極尖端距離組織表面20μm。測量時，計算機控制電極在距離組織表面20μm和50μm的兩點間移動，頻率為0.2Hz。記錄的電勢差使用校正電極的Nernst斜率轉換成電化學電勢差，離子的流動通過MAGEFLUX進行計算。

葉片表皮組織用鑷子從葉表皮分離得到，切取小塊組織（3-×4mm），盡可能地避免對組織的傷害，準備好幾小時后開始離子流的測定，使用NMT(或稱MINF)測定擬南芥的根尖（切取大約8mm的根尖部分）。根或者葉片水平固定在4mL 的測量容器中，測試液是堿性溶液，包括0.2mM KCl，2mM MES，4mM Tris （pH 5.8），以及少量的CaCl₂，放在三維操作系統上。穩定狀態的離子流測定5-10分鐘。然后測定的結果轉換成離子流動力學。

研究結果

1 擬南芥根和葉片中NaCl誘導Ca²⁺敏感的K⁺外流

根成熟表皮（A）和葉肉組織（B）在不同的Ca²⁺濃度中K⁺流速的不同響應

2 NaCl誘導K⁺外流與Cl^-或滲透刺激無關，對TEA⁺敏感

NaCl誘導的K⁺外流反應和Cl^-無關，由于50mM 葡萄糖酸鈉在擬南芥根中引起和50mM NaCl基本同樣的反應。當添加等壓的85mM 的甘露醇來代替50mM 的NaCl時，沒有K⁺外流。同樣的結果也在葉肉組織中觀察到。NaCl誘導的K⁺外流很大程度上被K⁺通道抑制劑TEA⁺抑制，但是不被Ca²⁺通道抑制劑戊脈安（verapamil）抑制。對TEA⁺的敏感是K⁺通道內在的特性，與其他的陽離子滲透通道不同，例如NSCCs和Ca²⁺通道，這些對TEA⁺不敏感。

3 NaCl誘導的K⁺外流先于Na⁺的內流

向內調節不涉及到NaCl誘導的K⁺流失

提高Na⁺濃度誘導Ca²⁺敏感的凈K⁺的外流可能通過質膜TEA⁺敏感的外表直接的K⁺通道的活化作用所調節。

研究結論

NaCl引起的K⁺流失是由于Na⁺誘導的TEA⁺敏感K⁺的外流，非常可能是由兩個滲透通道的成員DAPCs和NSCCs調節。提高調節了擬南芥根和葉片中的這些通道并且阻止了K⁺的流失。在鹽脅迫下，Na⁺顯著抑制DAOCs，但是不抑制NSCCs。因此，K⁺外流的敏感成分很大程度上視NSCCs的情況而定。這些結果挑戰Ca²⁺在植物中發揮作用機制的傳統觀點。Ca²⁺對Na⁺內流的抑制效應是通過NSCCs實現的，非質體Ca²⁺通過直接和間接調節K⁺外流通道來阻止K⁺的流失。

采用非損傷微測技術來測定K⁺和Na⁺的凈流量以及胞液中K⁺流速，探明了K⁺通道中的K⁺變化情況。對于認識鹽脅迫下不同離子所引起的抗性作用有重要的意義。非損傷微測技術能夠精確地測定離子流的瞬時變化以及長期變化的過程。由于它所具有的這種優勢，已經在小分子物質的測定方面得到廣泛的應用。在此文中，這個技術的應用對于揭開Ca²⁺所引起的K⁺滲透通道來改善K⁺流失并去除Na⁺的毒害有明顯優勢。

參考文章：

Shabala S, Demidchik V, Shabala L, Cuin TA, Smith SJ, Miller AJ, Davies JM, and Newman IA. (2006) Extracellular Ca²⁺ ameliorates NaCl-induced K⁺ loss from Arabidopsis root and leaf cells by controlling plasma membrane K⁺-permeable channels. Plant Physiology, 141: 1653-1665

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