層析技術(shù)概述
層析法又稱色層分析法或色譜法（Chromatography），它是在1903-1906年由俄國植物學(xué)家M. Tswett首先系統(tǒng)提出來的。他將葉綠素的石油醚溶液通過CaCO3管柱，并繼續(xù)以石油醚淋洗，由于CaCO3對葉綠素中各種色素的吸附能力不同，色素被逐漸分離，在管柱中出現(xiàn)了不同顏色的譜帶或稱色譜圖（Chromatogram）。
當(dāng)時這種方法并沒引起人們的足夠注意，直到1931年將該方法應(yīng)用到分離復(fù)雜的有機(jī)混合物，人們才發(fā)現(xiàn)了它的廣泛用途。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及生產(chǎn)實(shí)踐的需要，層析技術(shù)也得到了迅速的發(fā)展。為此作出重要貢獻(xiàn)的當(dāng)推英國生物學(xué)家Martin和Synge。他們首先提出了色譜塔板理論。這是在色譜柱操作參數(shù)基礎(chǔ)上模擬蒸餾理論，以理論塔板來表示分離效率，定量的描述、評價層析分離過程。其次，他們根據(jù)液－液逆流萃取的原理，發(fā)明了液－液分配色譜。特別是他們提出了遠(yuǎn)見卓識的預(yù)言：一、流動相可用氣體代替液體，與液體相比，物質(zhì)間的作用力減小了，這對分離更有好處；二、使用非常細(xì)的顆粒填料并在柱兩端施加較大的壓差，應(yīng)能得到最小的理論塔板高(即增加了理論塔板數(shù))，這將會大大提高分離效率。前者預(yù)見了氣相色譜的產(chǎn)生，并在1952年誕生了氣相色譜儀，它給揮發(fā)性的化合物的分離測定帶來了劃時代的變革；后者預(yù)見了高效液相色譜（HPLC）的產(chǎn)生，在60年代末也為人們所實(shí)現(xiàn)，現(xiàn)在HPLC已成為生物化學(xué)與分子生物學(xué)、化學(xué)等領(lǐng)域不可缺少的分析分離工具之一。因此, Martin和Synge于1952年被授予諾貝爾化學(xué)獎。如今的色層分析法經(jīng)常用于分離無色的物質(zhì)，已沒有顏色這個特殊的含義。但色譜法或色層分析法這個名字仍保留下來沿用。現(xiàn)在我們簡稱為層析法或?qū)游黾夹g(shù)。
層析法的最大特點(diǎn)是分離效率高，它能分離各種性質(zhì)極相類似的物質(zhì)。而且它既可以用于少量物質(zhì)的分析鑒定，又可用于大量物質(zhì)的分離純化制備。因此，作為一種重要的分析分離手段與方法，它廣泛地應(yīng)用于科學(xué)研究與工業(yè)生產(chǎn)上。現(xiàn)在，它在石油、化工、醫(yī)藥衛(wèi)生、生物科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)等領(lǐng)域都發(fā)揮著十分重要的作用。
層析的基本理論
層析法是一種基于被分離物質(zhì)的物理、化學(xué)及生物學(xué)特性的不同，使它們在某種基質(zhì)中移動速度不同而進(jìn)行分離和分析的方法。例如：我們利用物質(zhì)在溶解度、吸附能力、立體化學(xué)特性及分子的大小、帶電情況及離子交換、親和力的大小及特異的生物學(xué)反應(yīng)等方面的差異，使其在流動相與固定相之間的分配系數(shù)（或稱分配常數(shù)）不同，達(dá)到彼此分離的目的。
對于一個層析柱來說，可作如下基本假設(shè)：
1. 層析柱的內(nèi)徑和柱內(nèi)的填料是均勻的，而且層析柱由若干層組成。每層高度為H，稱為一個理論塔板。塔板一部分為固定相占據(jù)，一部分為流動相占據(jù)，且各塔板的流動相體積相等，稱為板體積，以Vm表示。
2. 每個塔板內(nèi)溶質(zhì)分子在固定相與流動相之間瞬間達(dá)到平衡，且忽略分子縱向擴(kuò)散。
3. 溶質(zhì)在各塔板上的分配系數(shù)是一常數(shù)，與溶質(zhì)在塔板的量無關(guān)。
4. 流動相通過層析柱可以看成是脈沖式的間歇過程（即不連續(xù)過程）。從一個塔板到另一個塔板流動相體積為Vm。當(dāng)流過層析柱的流動相的體積為V時，則流動相在每個塔板上跳越的次數(shù)為n:n =
5. 溶質(zhì)開始加在層析柱的第零塔板上。根據(jù)以上假定，將連續(xù)的層析過程分解成了間歇的動作，這與多次萃取過程相似，一個理論塔板相當(dāng)于一個兩相平衡的小單元。
層析的基本概念
1. 固定相：
固定相是層析的一個基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進(jìn)行可逆的吸附，溶解，交換等作用。它對層析的效果起著關(guān)鍵的作用。
2. 流動相：
在層析過程中，推動固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個方向移動的液體、氣體或超臨界體等，都稱為流動相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時稱為展層劑。它也是層析分離中的重要影響因素之一。
3. 分配系數(shù)及遷移率（或比移值）：
分配系數(shù)是指在一定的條件下，某種組分在固定相和流動相中含量（濃度）的比值，常用K來表示。分配系數(shù)是層析中分離純化物質(zhì)的主要依據(jù)。
K=Cs/Cm
其中Cs: 固定相中的濃度，Cm: 流動相中的濃度。
遷移率（或比移值）是指：在一定條件下，在相同的時間內(nèi)某一組分在固定相移動的距離與流動相本身移動的距離之比值。常用Rf來表示。（Rf大于或等于1）可以看出：K增加，Rf減少；反之，會減少，Rf增加。
實(shí)驗(yàn)中我們還常用相對遷移率的概念。相對遷移率是指：在一定條件下，在相同時間內(nèi)，某一組分在固定相中移動的距離與某一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在固定相中移動的距離之比值。它可以小于等于1，也可以大于1。用Rx來表示。不同物質(zhì)的分配系數(shù)或遷移率是不同的。分配系數(shù)或遷移率的差異程度是決定幾種物質(zhì)采用層析方法能否分離的先決條件。很顯然，差異越大，分離效果越理想。
分配系數(shù)主要與下列因素有關(guān)：①被分離物質(zhì)本身的性質(zhì)；②固定相和流動相的性質(zhì)；③層析柱的溫度。對于溫度的影響有下列關(guān)系式：
lnK = －(DG0/RT)
式中： K為分配系數(shù)（或平衡常數(shù)）
DG0為標(biāo)準(zhǔn)自由能變化
R為氣體常數(shù)
T為絕對溫度
這是層析分離的熱力學(xué)基礎(chǔ)。一般情況下，層析時組分的DG0為負(fù)值，則溫度與分配系數(shù)成反比關(guān)系。通常溫度上升20°C, K值下降一半，它將導(dǎo)致組分移動速率增加。這也是為什么在層析時最好采用恒溫柱的原因。有時對于K值相近的不同物質(zhì)，可通過改變溫度的方法，增大K值之間的差異，達(dá)到分離的目的。
4. 分辨率（或分離度）
分辨率一般定義為：相鄰兩個峰的分開程度。用Rs來表示。圖3－2 是計算分辨率的示意圖。
分辨率：
由上式可見，Rs值越大，兩種組分分離的越好。當(dāng)Rs = 1時，兩組分具有教好的分離，互相沾染約2%，即每種組分的純度約為98%。當(dāng)Rs=1.5時，兩組分基本完全分開，每種組分的純度可達(dá)到99.8%。如果兩種組分的濃度相差較大時，尤其要求較高的分辨率。
為了提高分辨率Rs 的值，可采用以下方法：
⑴ 使理論塔板數(shù)N增大，則Rs上升。
① 增加柱長，N可增大，可提高分離度，但它造成分離的時間加長，洗脫液體積增大，并使洗脫峰加寬，因此不是一種特別好的辦法。
② 減小理論塔板的高度。如減小固定相顆粒的尺寸，并加大流動相的壓力。高效液相色譜(HPLC)就是這一理論的實(shí)際應(yīng)用。一般液相層析的固定相顆粒為100mm；而HPLC柱子的固定相顆粒為10mm以下，且壓力可達(dá)150kg/cm。它使Rs大大提高，也使分離的效率大大提高了。
③ 采用適當(dāng)?shù)牧魉伲部墒估碚撍宓母叨冉档停龃罄碚撍鍞?shù)。太高或太低的流速都是不可取的。對于一個層析柱，它有一個最佳的流速。特別是對于氣相色譜，流速影響相當(dāng)大。
⑵ 改變?nèi)萘恳蜃覦（固定相與流動相中溶質(zhì)量的分布比）。一般是加大D，但D的數(shù)值通常不超過10，再大對提高Rs不明顯，反而使洗脫的時間延長，譜帶加寬。一般D限制在1 ￡ D ￡ 10，最佳范圍在1.5-5之間。我們可以通過改變柱溫（一般降低溫度），改變流動相的性質(zhì)及組成（如改變pH值，離子強(qiáng)度，鹽濃度，有機(jī)溶劑比例等），或改變固定相體積與流動相體積之比（如用細(xì)顆粒固定相，填充的緊密與均勻些），提高D值，使分離度增大。
⑶ 增大a（分離因子，也稱選擇性因子，是兩組分容量因子D之比），使Rs變大。實(shí)際上，使 a 增大，就是使兩種組分的分配系數(shù)差值增大。同樣，我們可以通過改變固定相的性質(zhì)、組成，改變流動相的性質(zhì)、組成，或者改變層析的溫度，使 a 發(fā)生改變。應(yīng)當(dāng)指出的是，溫度對分辨率的影響，是對分離因子與理論塔板高度的綜合效應(yīng)。因?yàn)闇囟壬撸碚撍甯叨扔袝r會降低，有時會升高，這要根據(jù)實(shí)際情況去選擇。通常，a 的變化對Rs影響最明顯。
總之，影響分離度或者說分離效率的因素是多方面的。我們應(yīng)當(dāng)根據(jù)實(shí)際情況綜合考慮，特別是對于生物大分子，我們還必須考慮它的穩(wěn)定性，活性等問題。如pH值、溫度等都會產(chǎn)生較大的影響，這是生化分離絕不能忽視的。否則，我們將不能得到預(yù)期的效果。
5. 正相色譜與反相色譜
正相色譜是指固定相的極性高于流動相的極性，因此，在這種層析過程中非極性分子或極性小的分子比極性大的分子移動的速度快，先從柱中流出來。
反相色譜是指固定相的極性低于流動相的極性，在這種層析過程中，極性大的分子比極性小的分子移動的速度快而先從柱中流出。
一般來說，分離純化極性大的分子（帶電離子等）采用正相色譜（或正相柱），而分離純化極性小的有機(jī)分子（有機(jī)酸、醇、酚等）多采用反相色譜（或反相柱）。
6. 操作容量（或交換容量）
在一定條件下，某種組分與基質(zhì)（固定相）反應(yīng)達(dá)到平衡時，存在于基質(zhì)上的飽和容量，我們稱為操作容量（或交換容量）。它的單位是毫摩爾（或毫克）/克（基質(zhì)）或毫摩爾（或毫克）/毫升（基質(zhì)），數(shù)值越大，表明基質(zhì)對該物質(zhì)的親合力越強(qiáng)。應(yīng)當(dāng)注意，同一種基質(zhì)對不同種類分子的操作容量是不相同的，這主要是由于分子大小（空間效應(yīng)）、帶電荷的多少、溶劑的性質(zhì)等多種因素的影響。因此，實(shí)際操作時，加入的樣品量要盡量少些，特別是生物大分子，樣品的加入量更要進(jìn)行控制，否則用層析辦法不能得到有效的分離。
層析法的分類
層析根據(jù)不同的標(biāo)準(zhǔn)可以分為多種類型:
1. 根據(jù)固定相基質(zhì)的形式分類，層析可以分為紙層析、薄層層析和柱層析。紙層析是指以濾紙作為基質(zhì)的層析。薄層層析是將基質(zhì)在玻璃或塑料等光滑表面鋪成一薄層，在薄層上進(jìn)行層析。柱層析則是指將基質(zhì)填裝在管中形成柱形，在柱中進(jìn)行層析。紙層析和薄層層析主要適用于小分子物質(zhì)的快速檢測分析和少量分離制備，通常為一次性使用，而柱層析是常用的層析形式，適用于樣品分析、分離。生物化學(xué)中常用的凝膠層析、離子交換層析、親和層析、高效液相色譜等都通常采用柱層析形式。
2. 根據(jù)流動相的形式分類，層析可以分為液相層析和氣相層析。氣相層析是指流動相為氣體的層析，而液相層析指流動相為液體的層析。氣相層析測定樣品時需要?dú)饣蟠笙拗屏似湓谏I(lǐng)域的應(yīng)用，主要用于氨基酸、核酸、糖類、脂肪酸等小分子的分析鑒定。而液相層析是生物領(lǐng)域最常用的層析形式，適于生物樣品的分析、分離。
3. 根據(jù)分離的原理不同分類，層析主要可以分為吸附層析、分配層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析等。
吸附層析是以吸附劑為固定相，根據(jù)待分離物與吸附劑之間吸附力不同而達(dá)到分離目的的一種層析技術(shù)。
分配層析是根據(jù)在一個有兩相同時存在的溶劑系統(tǒng)中，不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同而達(dá)到分離目的的一種層析技術(shù)。
凝膠過濾層析是以具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠顆粒作為固定相，根據(jù)物質(zhì)的分子大小進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。
離子交換層析是以離子交換劑為固定相，根據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)不同而進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。
親和層析是根據(jù)生物大分子和配體之間的特異性親和力（如酶和抑制劑、抗體和抗原、激素和受體等），將某種配體連接在載體上作為固定相，而對能與配體特異性結(jié)合的生物大分子進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。親和層析是分離生物大分子最為有效的層析技術(shù)，具有很高分辨率。
柱層析的基本裝置及基本操作
目前，最常用的層析類型是各種柱層析，下面就簡述柱層析的基本裝置及操作方法，薄層層析的裝置和操作將在后面詳細(xì)討論。
1. 柱層析的基本裝置
柱層析的基本裝置示意圖如圖3－3 所示：
2. 柱層析的基本操作
柱層析的基本操作包括以下一些步驟：
⑴ 裝柱
柱子裝的質(zhì)量好與差，是柱層析法能否成功分離純化物質(zhì)的關(guān)鍵步驟之一。一般要求柱子裝的要均勻，不能分層，柱子中不能有氣泡等。否則要重新裝柱。
首先選好柱子，根據(jù)層析的基質(zhì)和分離目的而定。一般柱子的直徑與長度比為1:10~50；凝膠柱可以選1:100~200，同時將柱子洗滌干凈。
將層析用的基質(zhì)（如吸附劑、樹脂、凝膠等）在適當(dāng)?shù)娜軇┗蚓彌_液中溶脹，并用適當(dāng)濃度的酸（0.5N~1N）、堿（0.5N~1N）、鹽（0.5M~1M）溶液洗滌處理，以除去其表面可能吸附的雜質(zhì)。然后用去離子水（或蒸餾水）洗滌干凈并真空抽氣（吸附劑等與溶液混合在一起），以除去其內(nèi)部的氣泡。
關(guān)閉層析柱出水口，并裝入1/3柱高的緩沖液，并將處理好的吸附劑等緩慢地倒入柱中，使其沉降約3cm高。
打開出水口，控制適當(dāng)流速，使吸附劑等均勻沉降，并不斷加入吸附劑溶液。（吸附劑的多少根據(jù)分離樣品的多少而定。）注意不能干柱、分層，否則必須重新裝柱。
最后使柱中基質(zhì)表面平坦并在表面上留有2~3cm高的緩沖液，同時關(guān)閉出水口。（采用機(jī)械化裝柱法在此省略。）
⑵ 平衡
柱子裝好后，要用所需的緩沖液（有一定的pH和離子強(qiáng)度）平衡柱子。用恒流泵在恒定壓力下走柱子（平衡與洗脫時的壓力盡可能保持相同）。平衡液體積一般為3~5倍柱床體積，以保證平衡后柱床體積穩(wěn)定及基質(zhì)充分平衡。如果需要，可用蘭色葡聚糖2000在恒壓下走柱，如色帶均勻下降，則說明柱子是均勻的。有時柱子平衡好后，還要進(jìn)行轉(zhuǎn)型處理。這方面的內(nèi)容在離子交換層析中加以介紹。
⑶ 加樣
加樣量的多少直接影響分離的效果。一般講，加樣量盡量少些，分離效果比較好。通常加樣量應(yīng)少于20%的操作容量，體積應(yīng)低于5%的床體積，對于分析性柱層析，一般不超過床體積的1%。當(dāng)然，最大加樣量必須在具體條件下多次試驗(yàn)后才能決定。
應(yīng)注意的是，加樣時應(yīng)緩慢小心地將樣品溶液加到固定相表面，盡量避免沖擊基質(zhì)，以保持基質(zhì)表面平坦。詳細(xì)操作見層析實(shí)驗(yàn)。
⑷ 洗脫
當(dāng)我們選定好洗脫液后，洗脫的方式可分為簡單洗脫、分步洗脫和梯度洗脫三種。
簡單洗脫：柱子始終用同樣的一種溶劑洗脫，直到層析分離過程結(jié)束為止。如果被分離物質(zhì)對固定相的親合力差異不大，其區(qū)帶的洗脫時間間隔（或洗脫體積間隔）也不長，采用這種方法是適宜的。但選擇的溶劑必須很合適方能使各組分的分配系數(shù)較大。否則應(yīng)采用下面的方法。
分步洗脫：這種方法按照遞增洗脫能力順序排列的幾種洗脫液，進(jìn)行逐級洗脫。它主要對混合物組成簡單、各組分性質(zhì)差異較大或需快速分離時適用。每次用一種洗脫液將其中一種組分快速洗脫下來。
梯度洗脫：當(dāng)混合物中組分復(fù)雜且性質(zhì)差異較小時，一般采用梯度洗脫。它的洗脫能力是逐步連續(xù)增加的，梯度可以指濃度、極性、離子強(qiáng)度或pH值等。最常用的是濃度梯度。在水溶液中，亦即離子強(qiáng)度梯度。可形成梯度的形式有三種，如圖3－4 所示（以鹽濃度梯度為例）：
我們可以通過下式計算得到流經(jīng)層析柱的洗脫液中鹽濃度的計算公式：
C = CB - ( CB - CA ) ( 1 - V2 / V1 )B1 / A1
式中： C ：流經(jīng)層析柱的洗脫液的鹽濃度
CB ：梯度混合器中B 瓶的鹽濃度（不攪拌）
CA ：梯度混合器中A 瓶的鹽濃度（攪拌）
B1 ：B 瓶的橫切面積
A1 ：A 瓶的橫切面積
V2 ：流經(jīng)層析柱的洗脫液體積
V1 ：梯度洗脫液總體積
洗脫條件的選擇，也是影響層析效果的重要因素。當(dāng)對所分離的混合物的性質(zhì)了解較少時，一般先采用線性梯度洗脫的方式去嘗試，但梯度的斜率要小一些，盡管洗脫時間較長，但對性質(zhì)相近的組分分離更為有利。同時還應(yīng)注意洗脫時的速率。前面我們已經(jīng)談到，流速的快慢將影響理論塔板高度，從而影響分辨率。事實(shí)上，速度太快，各組分在固液兩相中平衡時間短，相互分不開，仍以混合組分流出。速度太慢，將增大物質(zhì)的擴(kuò)散，同樣達(dá)不到理想的分離效果。只有多次試驗(yàn)才會得到合適的流速。總之，我們必須經(jīng)過反復(fù)的試驗(yàn)與調(diào)整（可以用正交試驗(yàn)或優(yōu)選法），才能得到最佳的洗脫條件。還應(yīng)強(qiáng)調(diào)的一點(diǎn)是，在整個洗脫過程中，千萬不能干柱，否則分離純化將會前功盡棄。
⑸ 收集、鑒定及保存
在生化實(shí)驗(yàn)中，基本上我們都是采用部分收集器來收集分離純化的樣品。由于檢測系統(tǒng)的分辨率有限，洗脫峰不一定能代表一個純凈的組分。因此，每管的收集量不能太多，一般1ml-5ml / 管。如果分離的物質(zhì)性質(zhì)很相近，可低至0.5ml / 管。這視具體情況而定。在合并一個峰的各管溶液之前，還要進(jìn)行鑒定。例如，一個蛋白峰的各管溶液，我們要先用電泳法對各管進(jìn)行鑒定。對于是單條帶的，認(rèn)為已達(dá)電泳純，合并在一起。其他的另行處理。對于不同種類的物質(zhì)采用相應(yīng)的鑒定方法，在這里不再敘述。最后，為了保持所得產(chǎn)品的穩(wěn)定性與生物活性，我們一般采用透析除鹽、超濾或減壓薄膜濃縮，再冰凍干燥，得到干粉，在低溫下保存?zhèn)溆谩?
⑹ 基質(zhì)（吸附劑、交換樹脂或凝膠等）的再生
許多基質(zhì)（吸附劑、交換樹脂或凝膠等）可以反復(fù)使用多次，而且價格昂貴，所以層析后要回收處理，以備再用，嚴(yán)禁亂倒亂扔。這也是一個科研工作者的科學(xué)作風(fēng)問題。各種基質(zhì)的再生方法可參閱具體層析實(shí)驗(yàn)及有關(guān)文獻(xiàn)
當(dāng)時這種方法并沒引起人們的足夠注意，直到1931年將該方法應(yīng)用到分離復(fù)雜的有機(jī)混合物，人們才發(fā)現(xiàn)了它的廣泛用途。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及生產(chǎn)實(shí)踐的需要，層析技術(shù)也得到了迅速的發(fā)展。為此作出重要貢獻(xiàn)的當(dāng)推英國生物學(xué)家Martin和Synge。他們首先提出了色譜塔板理論。這是在色譜柱操作參數(shù)基礎(chǔ)上模擬蒸餾理論，以理論塔板來表示分離效率，定量的描述、評價層析分離過程。其次，他們根據(jù)液－液逆流萃取的原理，發(fā)明了液－液分配色譜。特別是他們提出了遠(yuǎn)見卓識的預(yù)言：一、流動相可用氣體代替液體，與液體相比，物質(zhì)間的作用力減小了，這對分離更有好處；二、使用非常細(xì)的顆粒填料并在柱兩端施加較大的壓差，應(yīng)能得到最小的理論塔板高(即增加了理論塔板數(shù))，這將會大大提高分離效率。前者預(yù)見了氣相色譜的產(chǎn)生，并在1952年誕生了氣相色譜儀，它給揮發(fā)性的化合物的分離測定帶來了劃時代的變革；后者預(yù)見了高效液相色譜（HPLC）的產(chǎn)生，在60年代末也為人們所實(shí)現(xiàn)，現(xiàn)在HPLC已成為生物化學(xué)與分子生物學(xué)、化學(xué)等領(lǐng)域不可缺少的分析分離工具之一。因此, Martin和Synge于1952年被授予諾貝爾化學(xué)獎。如今的色層分析法經(jīng)常用于分離無色的物質(zhì)，已沒有顏色這個特殊的含義。但色譜法或色層分析法這個名字仍保留下來沿用。現(xiàn)在我們簡稱為層析法或?qū)游黾夹g(shù)。
層析法的最大特點(diǎn)是分離效率高，它能分離各種性質(zhì)極相類似的物質(zhì)。而且它既可以用于少量物質(zhì)的分析鑒定，又可用于大量物質(zhì)的分離純化制備。因此，作為一種重要的分析分離手段與方法，它廣泛地應(yīng)用于科學(xué)研究與工業(yè)生產(chǎn)上。現(xiàn)在，它在石油、化工、醫(yī)藥衛(wèi)生、生物科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)等領(lǐng)域都發(fā)揮著十分重要的作用。
層析的基本理論
層析法是一種基于被分離物質(zhì)的物理、化學(xué)及生物學(xué)特性的不同，使它們在某種基質(zhì)中移動速度不同而進(jìn)行分離和分析的方法。例如：我們利用物質(zhì)在溶解度、吸附能力、立體化學(xué)特性及分子的大小、帶電情況及離子交換、親和力的大小及特異的生物學(xué)反應(yīng)等方面的差異，使其在流動相與固定相之間的分配系數(shù)（或稱分配常數(shù)）不同，達(dá)到彼此分離的目的。
對于一個層析柱來說，可作如下基本假設(shè)：
1. 層析柱的內(nèi)徑和柱內(nèi)的填料是均勻的，而且層析柱由若干層組成。每層高度為H，稱為一個理論塔板。塔板一部分為固定相占據(jù)，一部分為流動相占據(jù)，且各塔板的流動相體積相等，稱為板體積，以Vm表示。
2. 每個塔板內(nèi)溶質(zhì)分子在固定相與流動相之間瞬間達(dá)到平衡，且忽略分子縱向擴(kuò)散。
3. 溶質(zhì)在各塔板上的分配系數(shù)是一常數(shù)，與溶質(zhì)在塔板的量無關(guān)。
4. 流動相通過層析柱可以看成是脈沖式的間歇過程（即不連續(xù)過程）。從一個塔板到另一個塔板流動相體積為Vm。當(dāng)流過層析柱的流動相的體積為V時，則流動相在每個塔板上跳越的次數(shù)為n:n =
5. 溶質(zhì)開始加在層析柱的第零塔板上。根據(jù)以上假定，將連續(xù)的層析過程分解成了間歇的動作，這與多次萃取過程相似，一個理論塔板相當(dāng)于一個兩相平衡的小單元。
層析的基本概念
1. 固定相：
固定相是層析的一個基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進(jìn)行可逆的吸附，溶解，交換等作用。它對層析的效果起著關(guān)鍵的作用。
2. 流動相：
在層析過程中，推動固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個方向移動的液體、氣體或超臨界體等，都稱為流動相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時稱為展層劑。它也是層析分離中的重要影響因素之一。
3. 分配系數(shù)及遷移率（或比移值）：
分配系數(shù)是指在一定的條件下，某種組分在固定相和流動相中含量（濃度）的比值，常用K來表示。分配系數(shù)是層析中分離純化物質(zhì)的主要依據(jù)。
K=Cs/Cm
其中Cs: 固定相中的濃度，Cm: 流動相中的濃度。
遷移率（或比移值）是指：在一定條件下，在相同的時間內(nèi)某一組分在固定相移動的距離與流動相本身移動的距離之比值。常用Rf來表示。（Rf大于或等于1）可以看出：K增加，Rf減少；反之，會減少，Rf增加。
實(shí)驗(yàn)中我們還常用相對遷移率的概念。相對遷移率是指：在一定條件下，在相同時間內(nèi)，某一組分在固定相中移動的距離與某一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在固定相中移動的距離之比值。它可以小于等于1，也可以大于1。用Rx來表示。不同物質(zhì)的分配系數(shù)或遷移率是不同的。分配系數(shù)或遷移率的差異程度是決定幾種物質(zhì)采用層析方法能否分離的先決條件。很顯然，差異越大，分離效果越理想。
分配系數(shù)主要與下列因素有關(guān)：①被分離物質(zhì)本身的性質(zhì)；②固定相和流動相的性質(zhì)；③層析柱的溫度。對于溫度的影響有下列關(guān)系式：
lnK = －(DG0/RT)
式中： K為分配系數(shù)（或平衡常數(shù)）
DG0為標(biāo)準(zhǔn)自由能變化
R為氣體常數(shù)
T為絕對溫度
這是層析分離的熱力學(xué)基礎(chǔ)。一般情況下，層析時組分的DG0為負(fù)值，則溫度與分配系數(shù)成反比關(guān)系。通常溫度上升20°C, K值下降一半，它將導(dǎo)致組分移動速率增加。這也是為什么在層析時最好采用恒溫柱的原因。有時對于K值相近的不同物質(zhì)，可通過改變溫度的方法，增大K值之間的差異，達(dá)到分離的目的。
4. 分辨率（或分離度）
分辨率一般定義為：相鄰兩個峰的分開程度。用Rs來表示。圖3－2 是計算分辨率的示意圖。
分辨率：
由上式可見，Rs值越大，兩種組分分離的越好。當(dāng)Rs = 1時，兩組分具有教好的分離，互相沾染約2%，即每種組分的純度約為98%。當(dāng)Rs=1.5時，兩組分基本完全分開，每種組分的純度可達(dá)到99.8%。如果兩種組分的濃度相差較大時，尤其要求較高的分辨率。
為了提高分辨率Rs 的值，可采用以下方法：
⑴ 使理論塔板數(shù)N增大，則Rs上升。
① 增加柱長，N可增大，可提高分離度，但它造成分離的時間加長，洗脫液體積增大，并使洗脫峰加寬，因此不是一種特別好的辦法。
② 減小理論塔板的高度。如減小固定相顆粒的尺寸，并加大流動相的壓力。高效液相色譜(HPLC)就是這一理論的實(shí)際應(yīng)用。一般液相層析的固定相顆粒為100mm；而HPLC柱子的固定相顆粒為10mm以下，且壓力可達(dá)150kg/cm。它使Rs大大提高，也使分離的效率大大提高了。
③ 采用適當(dāng)?shù)牧魉伲部墒估碚撍宓母叨冉档停龃罄碚撍鍞?shù)。太高或太低的流速都是不可取的。對于一個層析柱，它有一個最佳的流速。特別是對于氣相色譜，流速影響相當(dāng)大。
⑵ 改變?nèi)萘恳蜃覦（固定相與流動相中溶質(zhì)量的分布比）。一般是加大D，但D的數(shù)值通常不超過10，再大對提高Rs不明顯，反而使洗脫的時間延長，譜帶加寬。一般D限制在1 ￡ D ￡ 10，最佳范圍在1.5-5之間。我們可以通過改變柱溫（一般降低溫度），改變流動相的性質(zhì)及組成（如改變pH值，離子強(qiáng)度，鹽濃度，有機(jī)溶劑比例等），或改變固定相體積與流動相體積之比（如用細(xì)顆粒固定相，填充的緊密與均勻些），提高D值，使分離度增大。
⑶ 增大a（分離因子，也稱選擇性因子，是兩組分容量因子D之比），使Rs變大。實(shí)際上，使 a 增大，就是使兩種組分的分配系數(shù)差值增大。同樣，我們可以通過改變固定相的性質(zhì)、組成，改變流動相的性質(zhì)、組成，或者改變層析的溫度，使 a 發(fā)生改變。應(yīng)當(dāng)指出的是，溫度對分辨率的影響，是對分離因子與理論塔板高度的綜合效應(yīng)。因?yàn)闇囟壬撸碚撍甯叨扔袝r會降低，有時會升高，這要根據(jù)實(shí)際情況去選擇。通常，a 的變化對Rs影響最明顯。
總之，影響分離度或者說分離效率的因素是多方面的。我們應(yīng)當(dāng)根據(jù)實(shí)際情況綜合考慮，特別是對于生物大分子，我們還必須考慮它的穩(wěn)定性，活性等問題。如pH值、溫度等都會產(chǎn)生較大的影響，這是生化分離絕不能忽視的。否則，我們將不能得到預(yù)期的效果。
5. 正相色譜與反相色譜
正相色譜是指固定相的極性高于流動相的極性，因此，在這種層析過程中非極性分子或極性小的分子比極性大的分子移動的速度快，先從柱中流出來。
反相色譜是指固定相的極性低于流動相的極性，在這種層析過程中，極性大的分子比極性小的分子移動的速度快而先從柱中流出。
一般來說，分離純化極性大的分子（帶電離子等）采用正相色譜（或正相柱），而分離純化極性小的有機(jī)分子（有機(jī)酸、醇、酚等）多采用反相色譜（或反相柱）。
6. 操作容量（或交換容量）
在一定條件下，某種組分與基質(zhì)（固定相）反應(yīng)達(dá)到平衡時，存在于基質(zhì)上的飽和容量，我們稱為操作容量（或交換容量）。它的單位是毫摩爾（或毫克）/克（基質(zhì)）或毫摩爾（或毫克）/毫升（基質(zhì)），數(shù)值越大，表明基質(zhì)對該物質(zhì)的親合力越強(qiáng)。應(yīng)當(dāng)注意，同一種基質(zhì)對不同種類分子的操作容量是不相同的，這主要是由于分子大小（空間效應(yīng)）、帶電荷的多少、溶劑的性質(zhì)等多種因素的影響。因此，實(shí)際操作時，加入的樣品量要盡量少些，特別是生物大分子，樣品的加入量更要進(jìn)行控制，否則用層析辦法不能得到有效的分離。
層析法的分類
層析根據(jù)不同的標(biāo)準(zhǔn)可以分為多種類型:
1. 根據(jù)固定相基質(zhì)的形式分類，層析可以分為紙層析、薄層層析和柱層析。紙層析是指以濾紙作為基質(zhì)的層析。薄層層析是將基質(zhì)在玻璃或塑料等光滑表面鋪成一薄層，在薄層上進(jìn)行層析。柱層析則是指將基質(zhì)填裝在管中形成柱形，在柱中進(jìn)行層析。紙層析和薄層層析主要適用于小分子物質(zhì)的快速檢測分析和少量分離制備，通常為一次性使用，而柱層析是常用的層析形式，適用于樣品分析、分離。生物化學(xué)中常用的凝膠層析、離子交換層析、親和層析、高效液相色譜等都通常采用柱層析形式。
2. 根據(jù)流動相的形式分類，層析可以分為液相層析和氣相層析。氣相層析是指流動相為氣體的層析，而液相層析指流動相為液體的層析。氣相層析測定樣品時需要?dú)饣蟠笙拗屏似湓谏I(lǐng)域的應(yīng)用，主要用于氨基酸、核酸、糖類、脂肪酸等小分子的分析鑒定。而液相層析是生物領(lǐng)域最常用的層析形式，適于生物樣品的分析、分離。
3. 根據(jù)分離的原理不同分類，層析主要可以分為吸附層析、分配層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析等。
吸附層析是以吸附劑為固定相，根據(jù)待分離物與吸附劑之間吸附力不同而達(dá)到分離目的的一種層析技術(shù)。
分配層析是根據(jù)在一個有兩相同時存在的溶劑系統(tǒng)中，不同物質(zhì)的分配系數(shù)不同而達(dá)到分離目的的一種層析技術(shù)。
凝膠過濾層析是以具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠顆粒作為固定相，根據(jù)物質(zhì)的分子大小進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。
離子交換層析是以離子交換劑為固定相，根據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)不同而進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。
親和層析是根據(jù)生物大分子和配體之間的特異性親和力（如酶和抑制劑、抗體和抗原、激素和受體等），將某種配體連接在載體上作為固定相，而對能與配體特異性結(jié)合的生物大分子進(jìn)行分離的一種層析技術(shù)。親和層析是分離生物大分子最為有效的層析技術(shù)，具有很高分辨率。
柱層析的基本裝置及基本操作
目前，最常用的層析類型是各種柱層析，下面就簡述柱層析的基本裝置及操作方法，薄層層析的裝置和操作將在后面詳細(xì)討論。
1. 柱層析的基本裝置
柱層析的基本裝置示意圖如圖3－3 所示：
2. 柱層析的基本操作
柱層析的基本操作包括以下一些步驟：
⑴ 裝柱
柱子裝的質(zhì)量好與差，是柱層析法能否成功分離純化物質(zhì)的關(guān)鍵步驟之一。一般要求柱子裝的要均勻，不能分層，柱子中不能有氣泡等。否則要重新裝柱。
首先選好柱子，根據(jù)層析的基質(zhì)和分離目的而定。一般柱子的直徑與長度比為1:10~50；凝膠柱可以選1:100~200，同時將柱子洗滌干凈。
將層析用的基質(zhì)（如吸附劑、樹脂、凝膠等）在適當(dāng)?shù)娜軇┗蚓彌_液中溶脹，并用適當(dāng)濃度的酸（0.5N~1N）、堿（0.5N~1N）、鹽（0.5M~1M）溶液洗滌處理，以除去其表面可能吸附的雜質(zhì)。然后用去離子水（或蒸餾水）洗滌干凈并真空抽氣（吸附劑等與溶液混合在一起），以除去其內(nèi)部的氣泡。
關(guān)閉層析柱出水口，并裝入1/3柱高的緩沖液，并將處理好的吸附劑等緩慢地倒入柱中，使其沉降約3cm高。
打開出水口，控制適當(dāng)流速，使吸附劑等均勻沉降，并不斷加入吸附劑溶液。（吸附劑的多少根據(jù)分離樣品的多少而定。）注意不能干柱、分層，否則必須重新裝柱。
最后使柱中基質(zhì)表面平坦并在表面上留有2~3cm高的緩沖液，同時關(guān)閉出水口。（采用機(jī)械化裝柱法在此省略。）
⑵ 平衡
柱子裝好后，要用所需的緩沖液（有一定的pH和離子強(qiáng)度）平衡柱子。用恒流泵在恒定壓力下走柱子（平衡與洗脫時的壓力盡可能保持相同）。平衡液體積一般為3~5倍柱床體積，以保證平衡后柱床體積穩(wěn)定及基質(zhì)充分平衡。如果需要，可用蘭色葡聚糖2000在恒壓下走柱，如色帶均勻下降，則說明柱子是均勻的。有時柱子平衡好后，還要進(jìn)行轉(zhuǎn)型處理。這方面的內(nèi)容在離子交換層析中加以介紹。
⑶ 加樣
加樣量的多少直接影響分離的效果。一般講，加樣量盡量少些，分離效果比較好。通常加樣量應(yīng)少于20%的操作容量，體積應(yīng)低于5%的床體積，對于分析性柱層析，一般不超過床體積的1%。當(dāng)然，最大加樣量必須在具體條件下多次試驗(yàn)后才能決定。
應(yīng)注意的是，加樣時應(yīng)緩慢小心地將樣品溶液加到固定相表面，盡量避免沖擊基質(zhì)，以保持基質(zhì)表面平坦。詳細(xì)操作見層析實(shí)驗(yàn)。
⑷ 洗脫
當(dāng)我們選定好洗脫液后，洗脫的方式可分為簡單洗脫、分步洗脫和梯度洗脫三種。
簡單洗脫：柱子始終用同樣的一種溶劑洗脫，直到層析分離過程結(jié)束為止。如果被分離物質(zhì)對固定相的親合力差異不大，其區(qū)帶的洗脫時間間隔（或洗脫體積間隔）也不長，采用這種方法是適宜的。但選擇的溶劑必須很合適方能使各組分的分配系數(shù)較大。否則應(yīng)采用下面的方法。
分步洗脫：這種方法按照遞增洗脫能力順序排列的幾種洗脫液，進(jìn)行逐級洗脫。它主要對混合物組成簡單、各組分性質(zhì)差異較大或需快速分離時適用。每次用一種洗脫液將其中一種組分快速洗脫下來。
梯度洗脫：當(dāng)混合物中組分復(fù)雜且性質(zhì)差異較小時，一般采用梯度洗脫。它的洗脫能力是逐步連續(xù)增加的，梯度可以指濃度、極性、離子強(qiáng)度或pH值等。最常用的是濃度梯度。在水溶液中，亦即離子強(qiáng)度梯度。可形成梯度的形式有三種，如圖3－4 所示（以鹽濃度梯度為例）：
我們可以通過下式計算得到流經(jīng)層析柱的洗脫液中鹽濃度的計算公式：
C = CB - ( CB - CA ) ( 1 - V2 / V1 )B1 / A1
式中： C ：流經(jīng)層析柱的洗脫液的鹽濃度
CB ：梯度混合器中B 瓶的鹽濃度（不攪拌）
CA ：梯度混合器中A 瓶的鹽濃度（攪拌）
B1 ：B 瓶的橫切面積
A1 ：A 瓶的橫切面積
V2 ：流經(jīng)層析柱的洗脫液體積
V1 ：梯度洗脫液總體積
洗脫條件的選擇，也是影響層析效果的重要因素。當(dāng)對所分離的混合物的性質(zhì)了解較少時，一般先采用線性梯度洗脫的方式去嘗試，但梯度的斜率要小一些，盡管洗脫時間較長，但對性質(zhì)相近的組分分離更為有利。同時還應(yīng)注意洗脫時的速率。前面我們已經(jīng)談到，流速的快慢將影響理論塔板高度，從而影響分辨率。事實(shí)上，速度太快，各組分在固液兩相中平衡時間短，相互分不開，仍以混合組分流出。速度太慢，將增大物質(zhì)的擴(kuò)散，同樣達(dá)不到理想的分離效果。只有多次試驗(yàn)才會得到合適的流速。總之，我們必須經(jīng)過反復(fù)的試驗(yàn)與調(diào)整（可以用正交試驗(yàn)或優(yōu)選法），才能得到最佳的洗脫條件。還應(yīng)強(qiáng)調(diào)的一點(diǎn)是，在整個洗脫過程中，千萬不能干柱，否則分離純化將會前功盡棄。
⑸ 收集、鑒定及保存
在生化實(shí)驗(yàn)中，基本上我們都是采用部分收集器來收集分離純化的樣品。由于檢測系統(tǒng)的分辨率有限，洗脫峰不一定能代表一個純凈的組分。因此，每管的收集量不能太多，一般1ml-5ml / 管。如果分離的物質(zhì)性質(zhì)很相近，可低至0.5ml / 管。這視具體情況而定。在合并一個峰的各管溶液之前，還要進(jìn)行鑒定。例如，一個蛋白峰的各管溶液，我們要先用電泳法對各管進(jìn)行鑒定。對于是單條帶的，認(rèn)為已達(dá)電泳純，合并在一起。其他的另行處理。對于不同種類的物質(zhì)采用相應(yīng)的鑒定方法，在這里不再敘述。最后，為了保持所得產(chǎn)品的穩(wěn)定性與生物活性，我們一般采用透析除鹽、超濾或減壓薄膜濃縮，再冰凍干燥，得到干粉，在低溫下保存?zhèn)溆谩?
⑹ 基質(zhì)（吸附劑、交換樹脂或凝膠等）的再生
許多基質(zhì)（吸附劑、交換樹脂或凝膠等）可以反復(fù)使用多次，而且價格昂貴，所以層析后要回收處理，以備再用，嚴(yán)禁亂倒亂扔。這也是一個科研工作者的科學(xué)作風(fēng)問題。各種基質(zhì)的再生方法可參閱具體層析實(shí)驗(yàn)及有關(guān)文獻(xiàn)
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