淺談全內反射熒光顯微術及其在生物學中的應用
摘要：全內反射熒光顯微術是近年來新興的一種光學成像技術,它利用全內反射產生的隱失場來照明樣品,從而致使在百納米級厚的光學薄層內的熒光團受到激發,熒光成像的信噪比大大提高。近年來，全內反射熒光顯微術已被生物物理學家們廣泛應用于單分子的熒光成像中。本文簡要介紹了全內反射熒光顯微技術的基本知識及其在生物學方面的一些應用。
關鍵詞：全內反射熒光顯微術隱失波 生物單分子
引言：世界上第一臺光學顯微鏡的產生，使人們能夠觀察到肉眼不能觀察到的東西。經過幾百年的發展，經過物理學家的不斷努力，顯微鏡的性能不斷提高，成像質量大為改進。許多新的光學顯微鏡也應運而生，如偏振光顯微鏡、相差顯微鏡、倒置顯微鏡等。但是，在細胞生物學方面傳統光學顯微鏡始終不能解決生物樣本顯微中的幾個重要問題：1.顯微圖像的信噪比不高2.光源對生物樣本照射的損傷3.光學衍射所致的分辨極限（R ≥0. 61λ/nsinθ）。而這三個問題恰恰是生物單分子探測中亟待解決的問題。
20 世紀30 年代電子顯微鏡的發展導致了細胞研究的革命,使得生物學家得以從亞顯微水平上認識細胞世界。進入80 年代,非光學類掃描探針顯微術特別是原子力顯微鏡的出現更是將成像的分辨率推進到納米的精度。與此同時,新一代光學顯微技術也應運而生，它們以其高的空間分辨率和時間分辨率、無損傷、以及對單分子活體探測的可行性,再次成為生物學家、物理學家和成像學家們研究的熱點。目前國際上公認的最有前途的單分子光學成像技術有全場相襯顯微術、共焦熒光顯微術,近場光學掃描顯微術和全內反射熒光顯微術[1]。這些技術在分子生物學、分子化學、激光醫學及納米材料等領域受到廣泛關注,并產生了深遠的影響。
全內反射熒光顯微術是近年來新興的一種光學成像技術,它利用全內反射產生的隱失場來照明樣品,從而致使在百納米級厚的光學薄層內的熒光團受到激發,熒光成像的信噪比大大提高。Hirsch field于1965年完成了第一個全內反射熒光實驗,這是首次嘗試用全內反射熒光法測液體中的單個分子的熒光。將全反射理論與生物細胞的熒光成像技術相結合的TIR-FM技術是一種全新的突破.雖然它的具體應用還不到10年的時間,但是它在單分子探測中已顯示出強大的生命力.1995年,Yanagida小組用TIRFM技術首次在液體溶液中得到了熒光標記的單個蛋白質分子的成像.1996年,Moerner小組又用這項技術實現了限制在丙烯酰胺膠體的納米孔中的單分子的三維成像.
至今,全內反射熒光法在理論上和應用上均已得到較大發展,出現了多種全內反射熒光法,如時間分辨全內反射熒光、多重內反射熒光和全內反射熒光相關光譜等方法。全內反射熒光配合偏振技術和時間分辨技術在研究表面分子或近表面分子的取向、旋轉和熒光壽命方面已取得很好的效果。
全內反射的基本理論[2][3]
全內反射 全內反射現象是生活中的一種常見現象，如鉆石的色彩斑斕和光纖的光線傳播等。如圖1所示 ，當一束平面光波從折射率為n1的介質進入到折射率為n2的介質中。入射光在兩介質接觸面一部分發生反射，一部分發生折射。入射角θ1和透射角θ2之間滿足關系式
n1sin θ1=n2 sin θ2 （1）
若n1大于n2，由公式（1）可以看出當入射角增大時，透射角也增大。假設增大到臨界角θc時的透射角為90°。當光線以大于或者等于臨界角θc入射時，入射光在界面處只發生反射而不再透射進n2介質，也就是發生了全反射。由snell定律可知
θ2=90° θc=sin-1(n2/n1) （2）
由上式可知，當n1大于n2時，全反射就可能發生。如果玻璃的折射率取為1.52，溶液的折射率取為1.33(生物細胞的折射率范圍是1.33～1.38)，則玻璃/界面處的臨界角為61.74°。即當光線從玻璃中射入溶液中時，入射角大于61.74°時就會發生全反射。
隱失波 從幾何光學的角度來看,當發生全反射時,光會在玻璃界面上完全反射而不進入液體溶液中。實際上,由于波動效應,有一部分光的能量會穿過界面滲透到溶液中,平行于界面傳播。這部分光就是所謂的隱失波。隱失波是一種非均勻波，它沿著入射面上的介質邊界傳播，在平行界面方向以平行波場方式傳播而在垂直界面方向則是呈指數衰減。透射強度和浸透深度公式如公式（3）所示。由公式知，對于可見光波長而言，浸透深度為～100nm。
全內反射熒光顯微鏡
到目前，科學家們已經發展了多種全內反射熒光顯微成像系統。其中最為普遍的兩種類型是棱鏡型和物鏡型。（如圖2所示）棱鏡型成像系統的隱失場是通過入射光經棱鏡發生全反射產生的，而物鏡型的是通過入射光經物鏡本身全反射產生。隱失波激發生物樣品的熒光分子，熒光分子所發射的熒光經過物鏡成像到照相機或CCD上實現對生物樣品的記錄。（如圖3所示）
兩種形式的顯微鏡各有優缺點，對于棱鏡型而言，實現起來相對簡單，同時它的缺點也很明顯：由于要達到較高的光學分辨率，要求接收熒光的物鏡工作距離較短，這樣留給生物樣品和物鏡之間的空間較小，所以在此儀器上安裝一些諸如原子力顯微鏡、近場光學顯微鏡等其他探測儀器非常困難。并且由于熒光的接收必須經過圖2（a）所示的被觀察樣品的上部，這樣熒光必然會有散射、衰減及其它光信號的干擾，使觀察的效果有所下降。而對物鏡式而言，則可以克服以上缺點。物鏡式顯微鏡的物鏡既作為收集樣品熒光信號的接受器，同時又作為發生全反射的光學器件。如圖2（b）所示，激光聚焦到物鏡后焦面并經過物鏡邊緣入射，物鏡出射光為平行光并斜入射至蓋玻片上，調節激光入射位置和角度，即可達到全內反射要求，從而實現隱失波照明。隱失波所激發的熒光仍舊經過物鏡接收，通過雙色鏡濾掉除熒光以外的其它波長的光，成像在物鏡后方的照相機或CCD上，實現對生物樣品的熒光記錄。由于樣品上方空間完全空出，并且所接受的熒光沒有被樣品干擾，所以目前大多數生物學家采用物鏡式全內反射熒光顯微鏡。
在生物學上的應用
細胞內的很多至關重要的生命活動過程均存在于細胞表面,如果我們可以直接對這些細胞表面的過程進行觀測,而不受到來自細胞內深層區域信號的干擾,這對細胞生物學研究來說,將是具有重大意義的突破[5～7]。全內反射熒光顯微鏡的最大優勢就是利用隱失波照明,它的熒光激發深度只在～100ｎｍ的薄層范圍內,從而成為研究細胞表面科學如生物化學動力學、單分子動力學的最有前途的光學成像技術。
全內反射熒光法在生物中的應用主要體現在以下幾方面:蛋白質吸附平衡、表面分子濃度梯度變化、表面分子的旋轉、熒光壽命及反應速率的測量及選擇性觀測細胞/底物接觸區等。其中蛋白質界面吸附平衡是全內反射熒光法的重點應用領域[8]。可通過研究蛋白質在人工表面的吸附平衡來了解各種生物材料的表面性質。Edmisten等[9]利用全內反射熒光各向異性和吸收二色性結合研究細胞膜中的分子旋轉分布。Chan等[10]將全內反射熒光用于液-固界面的ＤＮＡ寡核苷酸的吸附和表面擴散研究。利用一種ｐＨ敏感熒光團產生的全內反射熒光,可觀測吸附水解酶的自發重構化[11]。全內反射熒光技術用于實時監測核酸相互作用[12]、考察吸附在石英上的水解酶分子的重定向機制[13],以及觀察細胞膜100ｎｍ范圍內的實時生命活動[14]也都有報道。
展望
全內反射熒光顯微術作為細胞表面單分子成像的一種新興的技術，Derek Toomre[2]等認為它將向兩個前沿方向發展，一方面是將繼續與其它顯微成像技術如熒光相關光譜技術(FCS),熒光壽命成像技術(FLIM)以及原子力顯微術(AFM)相結合;另一方面是發展雙色和多色TIR-FM，采用多種染色來觀察活體細胞。這兩個方面在近些年都有了很大發展，如Takafumi Yamada[15]等用AFM和TIR-FM結合觀察到高靈敏度的蛋白分子，Shhei Nishida[16]等對單細胞進行納米操作等。單波長光激發的雙色熒光觀察活細胞也有報道。[17，18]隨著光電探測設備探測效率和探測速度的提高以及單分子染色技術的發展，我們有理由相信，全內反射熒光顯微術將會更加清晰的將活體細胞膜表面的動態成像展現在我們面前。
參考文獻
[1] Humming Nie, Richard N. Zare. Optical detection of single molecule. Annul Rev Biophys Biomol Struct, 1997, 26: 567-596.
[2] Derek Toomre and Dietmar J. Man stein Lighting up the cell surface with
evanescent wave microscopy TRENDS in Cell Biology Vol.11 No.7 July 2001 298-303
[3] 王琛，王桂英，徐至展。全內反射熒光顯微術。物理學進展，2002，22：406-415.
[4] 白永強，劉丹，朱星 納米和生物單分子探測 物理評述 2004 33.（12）899-906
[5] Michaelis J, Hettich C, Mlynek J et al. Nature, 2000,405:325-28
[6] Ronald D, Valt, Takashi Funatsu, Danalel W.Pierce,et al. Nature, 1996,380:451-53
[7] Deniel W.pierce, NoraHom Booher, Ronald D.Vale.Nature, 1997,388
[8] AsanovAN, DelucasLJ, OldhamPB, WilsonW.J.ColloidInterface Sci 1997,191(1): 222-35
[9] EdmistonPL, Lee JE, Cheng SS, Saavedra SS.J.Amer.Chem.Soc.1997, 119(3) 560-70
[10] ChanV, Graves DJ, Fortina P, MckenzieSE, Langmuir, 1997,13(2) 320-29
[11] RobesonJL, Tilton RD. Langmuir, 1996,12:6104-6113
[12] LehrHP, ReimannM, BrandenburgA, SulzG, KlapprothH.Anal.Chem, 2003,75(10) 2414-20
[13] DalySM, PrzybycienTM, Tilton RD. Langmuir2003, 19(9) 3848-3857
[14] SteyerJA, Almers W.Nature Reviews Molecular Cell Biology.2001, 2(4) 268-75
[15] Takafumi Yamada, Rehana Afrin, Hideo Arakawa et al. High sensitivity detection
of protein molecules picked up on a probe of atomic force microscope based on the fluorescence detection by a total internal reflection fluorescence microscope FEBS Letters 569 (2004) 59–64
[16] Shuhei Nishida, Yutaka Funabashi, Atsushi Ikai Combination of AFM with an objective-type total internal reflection fluorescence microscope (TIRFM) for
nan manipulation of single cells Ultra microscopy 91 (2002) 269–27
[17] Tsuboi, T. et al. (2000) Simultaneous evanescent wave imaging of insulin vesicle membrane and cargo during a single exocytotic event. Curr. Biol. 10, 1307–1310
[18] Sako, Y. et al. (2000) Single-molecule imaging of EGFR signaling on the surface of living cells. Nat. Cell Biol. 2, 168–172
關鍵詞：全內反射熒光顯微術隱失波 生物單分子
引言：世界上第一臺光學顯微鏡的產生，使人們能夠觀察到肉眼不能觀察到的東西。經過幾百年的發展，經過物理學家的不斷努力，顯微鏡的性能不斷提高，成像質量大為改進。許多新的光學顯微鏡也應運而生，如偏振光顯微鏡、相差顯微鏡、倒置顯微鏡等。但是，在細胞生物學方面傳統光學顯微鏡始終不能解決生物樣本顯微中的幾個重要問題：1.顯微圖像的信噪比不高2.光源對生物樣本照射的損傷3.光學衍射所致的分辨極限（R ≥0. 61λ/nsinθ）。而這三個問題恰恰是生物單分子探測中亟待解決的問題。
20 世紀30 年代電子顯微鏡的發展導致了細胞研究的革命,使得生物學家得以從亞顯微水平上認識細胞世界。進入80 年代,非光學類掃描探針顯微術特別是原子力顯微鏡的出現更是將成像的分辨率推進到納米的精度。與此同時,新一代光學顯微技術也應運而生，它們以其高的空間分辨率和時間分辨率、無損傷、以及對單分子活體探測的可行性,再次成為生物學家、物理學家和成像學家們研究的熱點。目前國際上公認的最有前途的單分子光學成像技術有全場相襯顯微術、共焦熒光顯微術,近場光學掃描顯微術和全內反射熒光顯微術[1]。這些技術在分子生物學、分子化學、激光醫學及納米材料等領域受到廣泛關注,并產生了深遠的影響。
全內反射熒光顯微術是近年來新興的一種光學成像技術,它利用全內反射產生的隱失場來照明樣品,從而致使在百納米級厚的光學薄層內的熒光團受到激發,熒光成像的信噪比大大提高。Hirsch field于1965年完成了第一個全內反射熒光實驗,這是首次嘗試用全內反射熒光法測液體中的單個分子的熒光。將全反射理論與生物細胞的熒光成像技術相結合的TIR-FM技術是一種全新的突破.雖然它的具體應用還不到10年的時間,但是它在單分子探測中已顯示出強大的生命力.1995年,Yanagida小組用TIRFM技術首次在液體溶液中得到了熒光標記的單個蛋白質分子的成像.1996年,Moerner小組又用這項技術實現了限制在丙烯酰胺膠體的納米孔中的單分子的三維成像.
至今,全內反射熒光法在理論上和應用上均已得到較大發展,出現了多種全內反射熒光法,如時間分辨全內反射熒光、多重內反射熒光和全內反射熒光相關光譜等方法。全內反射熒光配合偏振技術和時間分辨技術在研究表面分子或近表面分子的取向、旋轉和熒光壽命方面已取得很好的效果。
全內反射的基本理論[2][3]
全內反射 全內反射現象是生活中的一種常見現象，如鉆石的色彩斑斕和光纖的光線傳播等。如圖1所示 ，當一束平面光波從折射率為n1的介質進入到折射率為n2的介質中。入射光在兩介質接觸面一部分發生反射，一部分發生折射。入射角θ1和透射角θ2之間滿足關系式
n1sin θ1=n2 sin θ2 （1）
若n1大于n2，由公式（1）可以看出當入射角增大時，透射角也增大。假設增大到臨界角θc時的透射角為90°。當光線以大于或者等于臨界角θc入射時，入射光在界面處只發生反射而不再透射進n2介質，也就是發生了全反射。由snell定律可知
θ2=90° θc=sin-1(n2/n1) （2）
由上式可知，當n1大于n2時，全反射就可能發生。如果玻璃的折射率取為1.52，溶液的折射率取為1.33(生物細胞的折射率范圍是1.33～1.38)，則玻璃/界面處的臨界角為61.74°。即當光線從玻璃中射入溶液中時，入射角大于61.74°時就會發生全反射。
隱失波 從幾何光學的角度來看,當發生全反射時,光會在玻璃界面上完全反射而不進入液體溶液中。實際上,由于波動效應,有一部分光的能量會穿過界面滲透到溶液中,平行于界面傳播。這部分光就是所謂的隱失波。隱失波是一種非均勻波，它沿著入射面上的介質邊界傳播，在平行界面方向以平行波場方式傳播而在垂直界面方向則是呈指數衰減。透射強度和浸透深度公式如公式（3）所示。由公式知，對于可見光波長而言，浸透深度為～100nm。
全內反射熒光顯微鏡
到目前，科學家們已經發展了多種全內反射熒光顯微成像系統。其中最為普遍的兩種類型是棱鏡型和物鏡型。（如圖2所示）棱鏡型成像系統的隱失場是通過入射光經棱鏡發生全反射產生的，而物鏡型的是通過入射光經物鏡本身全反射產生。隱失波激發生物樣品的熒光分子，熒光分子所發射的熒光經過物鏡成像到照相機或CCD上實現對生物樣品的記錄。（如圖3所示）
兩種形式的顯微鏡各有優缺點，對于棱鏡型而言，實現起來相對簡單，同時它的缺點也很明顯：由于要達到較高的光學分辨率，要求接收熒光的物鏡工作距離較短，這樣留給生物樣品和物鏡之間的空間較小，所以在此儀器上安裝一些諸如原子力顯微鏡、近場光學顯微鏡等其他探測儀器非常困難。并且由于熒光的接收必須經過圖2（a）所示的被觀察樣品的上部，這樣熒光必然會有散射、衰減及其它光信號的干擾，使觀察的效果有所下降。而對物鏡式而言，則可以克服以上缺點。物鏡式顯微鏡的物鏡既作為收集樣品熒光信號的接受器，同時又作為發生全反射的光學器件。如圖2（b）所示，激光聚焦到物鏡后焦面并經過物鏡邊緣入射，物鏡出射光為平行光并斜入射至蓋玻片上，調節激光入射位置和角度，即可達到全內反射要求，從而實現隱失波照明。隱失波所激發的熒光仍舊經過物鏡接收，通過雙色鏡濾掉除熒光以外的其它波長的光，成像在物鏡后方的照相機或CCD上，實現對生物樣品的熒光記錄。由于樣品上方空間完全空出，并且所接受的熒光沒有被樣品干擾，所以目前大多數生物學家采用物鏡式全內反射熒光顯微鏡。
在生物學上的應用
細胞內的很多至關重要的生命活動過程均存在于細胞表面,如果我們可以直接對這些細胞表面的過程進行觀測,而不受到來自細胞內深層區域信號的干擾,這對細胞生物學研究來說,將是具有重大意義的突破[5～7]。全內反射熒光顯微鏡的最大優勢就是利用隱失波照明,它的熒光激發深度只在～100ｎｍ的薄層范圍內,從而成為研究細胞表面科學如生物化學動力學、單分子動力學的最有前途的光學成像技術。
全內反射熒光法在生物中的應用主要體現在以下幾方面:蛋白質吸附平衡、表面分子濃度梯度變化、表面分子的旋轉、熒光壽命及反應速率的測量及選擇性觀測細胞/底物接觸區等。其中蛋白質界面吸附平衡是全內反射熒光法的重點應用領域[8]。可通過研究蛋白質在人工表面的吸附平衡來了解各種生物材料的表面性質。Edmisten等[9]利用全內反射熒光各向異性和吸收二色性結合研究細胞膜中的分子旋轉分布。Chan等[10]將全內反射熒光用于液-固界面的ＤＮＡ寡核苷酸的吸附和表面擴散研究。利用一種ｐＨ敏感熒光團產生的全內反射熒光,可觀測吸附水解酶的自發重構化[11]。全內反射熒光技術用于實時監測核酸相互作用[12]、考察吸附在石英上的水解酶分子的重定向機制[13],以及觀察細胞膜100ｎｍ范圍內的實時生命活動[14]也都有報道。
展望
全內反射熒光顯微術作為細胞表面單分子成像的一種新興的技術，Derek Toomre[2]等認為它將向兩個前沿方向發展，一方面是將繼續與其它顯微成像技術如熒光相關光譜技術(FCS),熒光壽命成像技術(FLIM)以及原子力顯微術(AFM)相結合;另一方面是發展雙色和多色TIR-FM，采用多種染色來觀察活體細胞。這兩個方面在近些年都有了很大發展，如Takafumi Yamada[15]等用AFM和TIR-FM結合觀察到高靈敏度的蛋白分子，Shhei Nishida[16]等對單細胞進行納米操作等。單波長光激發的雙色熒光觀察活細胞也有報道。[17，18]隨著光電探測設備探測效率和探測速度的提高以及單分子染色技術的發展，我們有理由相信，全內反射熒光顯微術將會更加清晰的將活體細胞膜表面的動態成像展現在我們面前。
參考文獻
[1] Humming Nie, Richard N. Zare. Optical detection of single molecule. Annul Rev Biophys Biomol Struct, 1997, 26: 567-596.
[2] Derek Toomre and Dietmar J. Man stein Lighting up the cell surface with
evanescent wave microscopy TRENDS in Cell Biology Vol.11 No.7 July 2001 298-303
[3] 王琛，王桂英，徐至展。全內反射熒光顯微術。物理學進展，2002，22：406-415.
[4] 白永強，劉丹，朱星 納米和生物單分子探測 物理評述 2004 33.（12）899-906
[5] Michaelis J, Hettich C, Mlynek J et al. Nature, 2000,405:325-28
[6] Ronald D, Valt, Takashi Funatsu, Danalel W.Pierce,et al. Nature, 1996,380:451-53
[7] Deniel W.pierce, NoraHom Booher, Ronald D.Vale.Nature, 1997,388
[8] AsanovAN, DelucasLJ, OldhamPB, WilsonW.J.ColloidInterface Sci 1997,191(1): 222-35
[9] EdmistonPL, Lee JE, Cheng SS, Saavedra SS.J.Amer.Chem.Soc.1997, 119(3) 560-70
[10] ChanV, Graves DJ, Fortina P, MckenzieSE, Langmuir, 1997,13(2) 320-29
[11] RobesonJL, Tilton RD. Langmuir, 1996,12:6104-6113
[12] LehrHP, ReimannM, BrandenburgA, SulzG, KlapprothH.Anal.Chem, 2003,75(10) 2414-20
[13] DalySM, PrzybycienTM, Tilton RD. Langmuir2003, 19(9) 3848-3857
[14] SteyerJA, Almers W.Nature Reviews Molecular Cell Biology.2001, 2(4) 268-75
[15] Takafumi Yamada, Rehana Afrin, Hideo Arakawa et al. High sensitivity detection
of protein molecules picked up on a probe of atomic force microscope based on the fluorescence detection by a total internal reflection fluorescence microscope FEBS Letters 569 (2004) 59–64
[16] Shuhei Nishida, Yutaka Funabashi, Atsushi Ikai Combination of AFM with an objective-type total internal reflection fluorescence microscope (TIRFM) for
nan manipulation of single cells Ultra microscopy 91 (2002) 269–27
[17] Tsuboi, T. et al. (2000) Simultaneous evanescent wave imaging of insulin vesicle membrane and cargo during a single exocytotic event. Curr. Biol. 10, 1307–1310
[18] Sako, Y. et al. (2000) Single-molecule imaging of EGFR signaling on the surface of living cells. Nat. Cell Biol. 2, 168–172
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com