生物醫(yī)學光學技術(shù)
摘 要：隨著生物分子光學標記技術(shù)的不斷進步，光學技術(shù)在揭示生命活動基本規(guī)律的研究中正發(fā)揮越來越重要的作用，也為醫(yī)學診斷與治療提供了更多、更有效的手段。本報告首先簡要介紹光學技術(shù)在生物醫(yī)學應用中的發(fā)展概況，然后從基因表達及蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用研究方面，討論生物分子光學技術(shù)的特點與優(yōu)勢，闡明基于分子光學標記的光學成像技術(shù)是重要的實時在體監(jiān)測手段，最后討論光學成像技術(shù)在組織功能/腦功能成像中的應用原理與現(xiàn)狀。
關(guān)鍵詞：光學技術(shù)、生物醫(yī)學、醫(yī)學診斷與治療、分子光子學、醫(yī)學成像
一、生物醫(yī)學光學發(fā)展概況
生物醫(yī)學光學（Biomedical Optics）是近年來受到國際光學界和生物醫(yī)學界廣泛關(guān)注的研究熱點，在生物活檢（使用光學相干弱層析成像技術(shù)——OCT）、光動力治療（PDT）、細胞結(jié)構(gòu)與功能檢測（運用激光共焦掃描顯微鏡）、基因表達規(guī)律的在體觀測（運用熒光基因標記技術(shù)）等問題上取得了可喜研究成果，目前正在從宏觀到微觀多層面上對大腦活動與功能進行研究。Science在最近幾年已發(fā)表相關(guān)論文近20篇。隨著光學技術(shù)的發(fā)展，生物醫(yī)學光學將在多層次上對研究生物體特別是人體的結(jié)構(gòu)、功能和其他生命現(xiàn)象產(chǎn)生重要影響。
二、生物分子光學技術(shù)
細胞重大生命活動的發(fā)生和調(diào)節(jié)是通過生物大分子間（蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)—核酸等）相互作用來實現(xiàn)的。深入研究基因表達及蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用不僅能揭示生命活動的基本規(guī)律，同時也能深入了解疾病發(fā)生的分子機制，進而為尋找更有效的藥物分子、提高藥物篩選和藥物設計的效率提供新的思路。
（一）現(xiàn)代分子生物學在研究基因表達和蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用中的局限性
現(xiàn)代分子生物學技術(shù)的迅速發(fā)展，特別是隨著后基因組時代的到來，人們已經(jīng)能夠根據(jù)需要建立各種細胞和動物模型，為在體研究基因表達規(guī)律、分子間的相互作用、腫瘤細胞的增殖、細胞信號轉(zhuǎn)導、誘導分化、細胞凋亡以及新的血管生成等提供了良好的生物學條件。
然而，盡管人們利用現(xiàn)有的分子生物學方法，已經(jīng)對基因表達和蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用進行了深入、細致的研究，但仍然不能實現(xiàn)對蛋白質(zhì)和基因活動的實時、動態(tài)監(jiān)測。在細胞的生理過程中，基因、尤其是蛋白質(zhì)的表達、修飾和相互作用往往發(fā)生可逆的、動態(tài)的變化。目前的分子生物學方法還不能捕獲到蛋白質(zhì)和基因的這些瞬時、動態(tài)、可逆的變化，但獲取這些信息對與研究基因的表達和蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)的相互作用又至關(guān)重要。因此，發(fā)展能用于活體、動態(tài)、實時、連續(xù)監(jiān)測蛋白質(zhì)和基因活動的方法非常必要。
光學成像技術(shù)與分子生物學技術(shù)的結(jié)合為研究上述科學問題提供了現(xiàn)實與可能。因此，在現(xiàn)代分子生物學技術(shù)基礎(chǔ)上，急需發(fā)展新的成像技術(shù)。在活體動物體內(nèi)，如何實現(xiàn)基因表達及蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用的實時在體成像監(jiān)測是當前迫切需要解決的重大核心科學技術(shù)問題！這是也生物學、信息科學（光學）和基礎(chǔ)臨床醫(yī)學等學科共同感興趣的重大基礎(chǔ)問題。對這一科學問題的研究不僅有助于闡明生命活動的基本規(guī)律、認識疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，而且對創(chuàng)新藥物研究、藥物療效評價以及發(fā)展疾病早期診斷技術(shù)（光子醫(yī)學診斷技術(shù)）等產(chǎn)生重大影響。
（二）基于分子光學標記的光學成像技術(shù)是重要的實時在體監(jiān)測手段
光學成像技術(shù)正成為實時在體研究分子間/分子內(nèi)蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用、離子通道、細胞膜蛋白及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導、生化底物及酶轉(zhuǎn)運等的重要手段，由于具有高時間、空間分辨率，比現(xiàn)有其他手段更為直接，因而可望成為后基因組時代新藥靶發(fā)現(xiàn)和高通量藥物篩選的新方法。
表1和表2分別給出了目前處于研究和應用階段的幾種主要成像技術(shù)的應用場合及參數(shù)比較。比較相關(guān)參數(shù)可以看出，基于分子光學標記的光學成像技術(shù)已經(jīng)在活體動物體內(nèi)基因表達規(guī)律方面展示了有較大的優(yōu)勢。
例如，正電子發(fā)射斷層成像（PET）可實現(xiàn)對分子代謝的成像，空間分辨率：1-2mm，時間分辨率：分鐘量級。與PET比較，光學成像的應用場合更廣（可測量更多的參數(shù)，請參見表1），且具有更高的時間分辨率（秒級），空間分辨率可達到微米。因此，二者比較，雖然光學成像在測量深度方面不及PET，但在測量參數(shù)種類與時空分辨方面有一定優(yōu)勢。對于小動物（如大鼠）研究來說，光學成像技術(shù)可以實現(xiàn)小動物整體成像和在體基因表達成像，例如，初步研究表明，熒光介導層析成像可達到近10cm的測量深度（Nature Reviews 2002）；基于多光子激發(fā)的顯微成像技術(shù)可望實現(xiàn)小鼠體內(nèi)基因表達的實時在體成像（Nature Medicine 2001）。
表1 主要成像技術(shù)及應用場合（Nature Reviews 2002）
成像方法 主要應用場合
磁共振成像（MRI） 高對比度，用于表型、生理成像和細胞跟蹤的最好的全方位成像系統(tǒng)。
計算機層析成像（CT） 肺和骨癌成像
超聲成像 血管和介入成像
正電子發(fā)射斷層成像PET 分子代謝，如葡萄糖，胸腺嘧啶核苷等的成像
單光子發(fā)射斷層成像SPECT 探針，如抗體，肽等的成像
熒光反射成像FRI 表面腫瘤分子事件的快速成像
熒光介導層析成像FMT 對深部腫瘤靶向標記或“靈活的”熒光染料標記進行定量成像
生物發(fā)光成像BLI 基因表達，細胞追蹤成像
活體顯微成像 以更高分辨率實現(xiàn)上述所有參數(shù)成像，但測量深度和范圍有限。
雖然在體光學成像技術(shù)在時/空分辨、實時、動態(tài)和多參數(shù)測量等方面有一定的優(yōu)勢，但仍然有大量的技術(shù)問題需要研究。例如，從光學標記角度看，如何針對所要研究的體系和對象，為實現(xiàn)在活細胞和動物體內(nèi)監(jiān)測基因表達及蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)的相互作用，發(fā)展特異性更高、更易于光學測量的核酸和蛋白質(zhì)探針，是當前要解決的關(guān)鍵技術(shù)問題之一。
表2 常用成像技術(shù)及參數(shù)比較（Nature Reviews 2002）
成像方法 空間分辨率 時間分辨率 測量深度 造影劑 價格
MRI 10-100m Min/hrs 無限制 釓，鏑和氧化鐵離子 $$$
CT 50m Min 無限制 碘 $$
超聲 50m Min mm 微型氣泡 $$
PET 1-2mm Min 無限制 18F，11C，15O $$$
SPECT 1-2mm Min 無限制 99mTc（亞穩(wěn)態(tài)锝）, 111In（銦） $$
熒光反射成像FRI 1-2mm Sec/min <1cm 熒光蛋白，近紅外熒光染料 $
熒光介導層析成像FMT 1-2mm Sec/min <10cm 近紅外熒光染料 $$
生物發(fā)光成像BLI 幾mm Min cm 螢光素 $$
活體顯微成像 1m Sec/min <400m 熒光蛋白，發(fā)光蛋白，近紅外熒光染料 $$$
其中：$表示價格<10萬美元；$$表示價格在10-30萬美元之間；$$$表示價格>30萬美元
表3簡要介紹了近幾年發(fā)展十分迅速、正受學術(shù)界高度關(guān)注的幾種研究活細胞內(nèi)基因表達與分子間相互作用動力學過程的光學成像技術(shù)的基本原理與特點，主要包括熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）、熒光壽命成像（FLIM）、熒光漂白后恢復（FRAP）、熒光漂白后定位（FLAP）、熒光關(guān)聯(lián)譜（FCS）和成像關(guān)聯(lián)譜（ICS）等。如何發(fā)展和整合相關(guān)的成像方法，并應用于在體成像，為基因表達和蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用研究提供更先進的手段，也應是本項目研究的關(guān)鍵技術(shù)問題。
在數(shù)據(jù)處理與可視化研究方面，也存在重大的科學問題。例如，對于600微米左右的熒光，雖然可以穿透較厚的組織而被探測到，但由于經(jīng)過了多次散射，如何定位發(fā)光位置，需要根據(jù)生物組織中的光子傳輸規(guī)律，通過圖像重建算法來實現(xiàn)，事實上這方面的研究已經(jīng)成為學術(shù)界的研究熱點。例如，基于成像測量（包括光學成像）的分子與細胞事件動力學過程的可視化研究被評為2002年Science的十大突破之一（Science, Dec.20, 2002）。
表3 活體細胞內(nèi)基因表達與分子間相互作用動力學過程的實時在體光學成像技術(shù)
名稱 原理與應用
熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET—Fluorescence Resonance Energy Transfer 供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過偶極子相互作用，實現(xiàn)了能量向鄰近的受體分子轉(zhuǎn)移。FRET可用于測量分子內(nèi)部間距，或蛋白質(zhì)的不同反應活性部位、模型系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)與脂質(zhì)、或細胞表面蛋白質(zhì)等分子之間的距離。即可測量分子間的接近度，距離，方位和動力學特性。由于FRET效率與供體受體間的距離成6次冪的關(guān)系，所以FRET效率對距離的變化非常靈敏，可以靈敏測量10Å-100Å范圍內(nèi)的距離變化。
熒光壽命成像FLIM—Fluorescence Lifetime IMaging 熒光壽命成像顯微鏡和壽命測量與熒光濃度或激發(fā)強度的變化無關(guān)，F(xiàn)RET與FLIM的結(jié)合可提供高的空間（納米）和時間（納秒）分辨率。通過供體壽命測量和處理時間分辯圖像，可精確計算相互作用的蛋白質(zhì)間的距離。由于只測量供體熒光壽命，在FRET—FLIM成像中，可不考慮光譜的交疊問題。
熒光漂白（后）恢復 FRAP—Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP是研究蛋白質(zhì)動力學的重要工具。在FRAP實驗中，利用激光脈沖有針對性對被熒光蛋白標記的細胞內(nèi)的一個小區(qū)域快速、不可逆地漂白。該漂白區(qū)域完全沒有熒光信號。然后使用延遲顯微鏡測量熒光信號隨時間的恢復情況。熒光的恢復是由未漂白的分子流入被漂白區(qū)域所造成的。因此熒光信號恢復的動力學過程含有了被標記蛋白的表觀遷移信息。
熒光漂白（后）定位 FLAP—Fluorescence Localization After Photobleaching FLAP是在活細胞內(nèi)對特定分子的光學標記進行定位和跟蹤的新方法。被定位的分子包括兩個熒光基團：一個被漂白，另一個則作為參考標記。與熒光漂白后恢復（FRAP）和熒光漂白中的損耗（FLIP）技術(shù)不同，利用參考熒光基團，通過簡單的圖像差異，即可跟蹤光學標記分子自身的分布。因此，F(xiàn)LAP實際上可與光敏化方法相對比。與籠鎖熒光探針方法相比，其主要優(yōu)點是可用于跟蹤細胞直接表達的嵌合熒光蛋白。
熒光關(guān)聯(lián)譜 FCS¬—Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS可用于分析小規(guī)模分子集合輻射行為所引起的微小的自發(fā)擾動，從而反映分子內(nèi)與分子間的動力學過程。由于FCS可觀察納摩爾（nanomolar）范圍的熒光分子，因而可在大的空間與時間范圍內(nèi)，非常近似地模仿不同過程中的實際生理條件，如結(jié)合與離解反應，生化底物的轉(zhuǎn)運、酶的周轉(zhuǎn)，分子內(nèi)（如結(jié)構(gòu)）的動力學過程等。FCS的時間分辨率也可以達到納秒（ns）量級。
成像關(guān)聯(lián)譜 ICS—Imaging Correlation Spectroscopy ICS為測量活細胞表面分子內(nèi)相互作用的動力學過程提供了一種新的方法，還可以幫助闡明細胞膜上蛋白質(zhì)的聯(lián)合是如何激活信號轉(zhuǎn)導通道的。ICS可測量分布在細胞表面的單個分子的密度、分子群、有組織的結(jié)構(gòu)或功能區(qū)。該技術(shù)可探測單個分子的空間分辨率約為200平方微米。由于與分子的總數(shù)目有關(guān)，因此可用于估計單分子實體（molecular entity）中的平均分子數(shù)目。
國際同行對動物活體內(nèi)基因表達與蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用的在體光學成像研究也非常重視。例如，美國NIH已經(jīng)召開過三次研討會，認為新的在體生物光子學方法可用于癌癥和其它疾病的早期檢測、診斷和治療。新一代的在體光學成像技術(shù)正處在從實驗室轉(zhuǎn)向癌癥臨床應用的重要時刻。在NIH的支持下，NCI（美國國家癌癥研究所）正在計劃5年投資1800萬美元，招標建立“在體光學成像和/或光譜技術(shù)轉(zhuǎn)化研究網(wǎng)絡（NTROI）”，其研究內(nèi)容主要包括：光學成像對比度的產(chǎn)生機理、在體光學成像技術(shù)與方法、臨床監(jiān)測、新光學成像方法的驗證、系統(tǒng)研制與集成等五個方面。美國NIH于2000年底成立了的國家生物醫(yī)學影像與生物工程研究所（NIBIB）,在其首批支持的項目中，光學成像方法約占30%。2000年7月，美國NIH投資2000萬美元，開展小動物成像方法項目（SAIRPs）研究，受到生命科學界的高度關(guān)注，其中光學成像方法也是其中的研究重點之一。NSF 在2000-2002年發(fā)布了四次Biophotonics Partnership Initiative 招標指南，呼吁開展多學科的合作研究。
（三）研究熱點與發(fā)展趨勢
從前面的討論中可以看出，研究熱點與發(fā)展趨勢應包括如下三個方面：
1. 生物分子的光學標記新技術(shù)研究。針對所研究的體系和對象，發(fā)展具有高度特異性的、可用于生物體內(nèi)活體成像的核酸和蛋白質(zhì)探針。例如研制新的發(fā)光蛋白用于動物模型體內(nèi)，實現(xiàn)蛋白質(zhì)在動物體內(nèi)的表達成像研究；設計并合成新型的具有高特異性的核酸探針，實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的活體監(jiān)測；發(fā)展在活體細胞內(nèi)監(jiān)測蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)的相互作用的新方法；發(fā)展新的表面修飾和標記方法，將熒光納米顆粒作為探針，用于活體細胞和動物器官的基因表達和蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)實時在體光學成像研究。
2. 在體光學成像新技術(shù)與應用研究。針對不同的研究對象和應用目標，發(fā)展各種新型的在體光學成像技術(shù)。例如實現(xiàn)小動物體內(nèi)深部目標探測的擴散光學成像方法；實現(xiàn)動物體內(nèi)藥代動力學和藥理學過程的實時在體成像監(jiān)測的相干域光學成像方法；實現(xiàn)對動物體內(nèi)基因表達和分子間相互作用過程在體成像監(jiān)測的多光子熒光等非線性光學成像方法；實現(xiàn)不同層次多參數(shù)測量的集成化在體光學成像系統(tǒng)；以及無須外源性標記的各類在體功能成像方法等。應用研究包括：a) 以小動物為研究對象，在動物體內(nèi)不同部位（如肺、肝、腦等）的腫瘤模型或其它疾病模型基礎(chǔ)上，研究在體基因表達規(guī)律，監(jiān)測腫瘤發(fā)生發(fā)展的動力學過程；對活體動物體內(nèi)分子與細胞事件進行定量成像研究，例如通過熒光標記蛋白的互補與重組策略，結(jié)合生物發(fā)光光學成像技術(shù)，可以實現(xiàn)對活體內(nèi)蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用的定量無損成像，從而有望提供一種有潛在價值的工具，對研究處于自然在體狀態(tài)環(huán)境下的細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用、對以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)相互作用為靶標的新藥的在體評估都具有非常重要的意義。動物組織、器官到整體水平的在體光學成像可望為研究藥物作用靶點和評價藥物作用效果提供重要技術(shù)手段。b) 以小動物體內(nèi)的活細胞為研究對象，用光學成像技術(shù)，實時在體研究細胞內(nèi)基因表達與分子間相互作用的動力學過程。例如，可文中提到的FRET、FLIM、FRAP、FLAP等技術(shù)研究蛋白質(zhì)分子間的相互作用、計算蛋白質(zhì)間的作用距離、特定分子在細胞內(nèi)移動、定位與跟蹤，以及蛋白質(zhì)的構(gòu)像變化等；運用FCS技術(shù)，在較大的空間與時間范圍內(nèi)，研究不同分子的結(jié)合與離解反應，生化底物的轉(zhuǎn)運、酶的周轉(zhuǎn)，以及分子內(nèi)（如結(jié)構(gòu)）變化的動力學過程等；運用ICS技術(shù)研究活細胞表面分子內(nèi)相互作用的動力學過程，研究細胞膜蛋白的聯(lián)合及其與信號轉(zhuǎn)導通道的激活關(guān)系等。
3. 數(shù)據(jù)處理、圖像重建與可視化方法研究。在光學成像檢測的基礎(chǔ)上，還需要開展數(shù)據(jù)處理、圖像重建與可視化方法研究。主要是根據(jù)光子傳輸規(guī)律和光學檢測模式，對所獲得的數(shù)據(jù)進行處理和可視化研究。
三、醫(yī)學光學成像技術(shù)
醫(yī)學光學成像技術(shù)從理論上可分為擴散光學成像與相干域光學成像，前者成像深度較深，理論基礎(chǔ)是光子輸運方程的擴散近似，被檢測的光學信號會在組織體內(nèi)經(jīng)歷多次散射，如何建立散射信息與組織光學特性參數(shù)變化間的關(guān)系和提取散射信息是其關(guān)鍵；后者成像深度主要在組織淺層，散射影響較小，如何避免散射和在強散射背景中提取有用的結(jié)構(gòu)與功能信息是其關(guān)鍵。
四、結(jié)論
生物醫(yī)學光學是新興交叉學科。光學技術(shù)為揭示生命活動的基本規(guī)律、臨床醫(yī)學診斷與治療提供了新的技術(shù)手段和方法，同時，生命科學的發(fā)展，也不斷對光學技術(shù)提出新的要求，促進了光學技術(shù)的發(fā)展。
作者簡介
駱清銘 博士，1966年1月生，教育部“長江學者獎勵計劃”特聘教授（首批），生物醫(yī)學光子學教育部重點實驗室主任，華中科技大學生命科學與技術(shù)學院院長。
現(xiàn)任國家863計劃生物信息技術(shù)主題管理專家，中國光學學會激光醫(yī)學分科學會主任委員，國際《生物醫(yī)學光學》(Journal of Biomedical Optics)雜志編委，《光電子•激光》雜志常務副主編，《激光生物學報》和《中國激光醫(yī)學雜志》副主編，《Chinese Optics Letters 中國光學快報》、《紅外與毫米波學報》，《中國醫(yī)療器械雜志》，《航天醫(yī)學與醫(yī)學工程》等雜志編委，《國外醫(yī)學—生物醫(yī)學工程分冊》特邀編輯。
五次擔任本學科國際會議主席，兩次應邀擔任香山科學會議執(zhí)行主席。
主持完成國家自然科學基金3項（其中重點項目1項，負責60%）；主持NSFC在研項目3項（含國家杰出青年科學基金），973前期研究專項1項。主持其它省部級以上項目5項。
獲國外專利4項，申請國內(nèi)專利5項；主編/參編專著5部（其中4部國外出版）；發(fā)表正式學術(shù)期刊論文80余篇，其中SCI、EI收錄超過60篇。
曾獲霍英東青年教師教學獎、中國青年科技獎、全國優(yōu)秀科技工作者等稱號。
工作單位：武漢 華中科技大學生命科學與技術(shù)學院
電話：027 8754 4624， 傳真：027-87542341
電子郵件：qluo@mail.hust.edu.cn
關(guān)鍵詞：光學技術(shù)、生物醫(yī)學、醫(yī)學診斷與治療、分子光子學、醫(yī)學成像
一、生物醫(yī)學光學發(fā)展概況
生物醫(yī)學光學（Biomedical Optics）是近年來受到國際光學界和生物醫(yī)學界廣泛關(guān)注的研究熱點，在生物活檢（使用光學相干弱層析成像技術(shù)——OCT）、光動力治療（PDT）、細胞結(jié)構(gòu)與功能檢測（運用激光共焦掃描顯微鏡）、基因表達規(guī)律的在體觀測（運用熒光基因標記技術(shù)）等問題上取得了可喜研究成果，目前正在從宏觀到微觀多層面上對大腦活動與功能進行研究。Science在最近幾年已發(fā)表相關(guān)論文近20篇。隨著光學技術(shù)的發(fā)展，生物醫(yī)學光學將在多層次上對研究生物體特別是人體的結(jié)構(gòu)、功能和其他生命現(xiàn)象產(chǎn)生重要影響。
二、生物分子光學技術(shù)
細胞重大生命活動的發(fā)生和調(diào)節(jié)是通過生物大分子間（蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)—核酸等）相互作用來實現(xiàn)的。深入研究基因表達及蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用不僅能揭示生命活動的基本規(guī)律，同時也能深入了解疾病發(fā)生的分子機制，進而為尋找更有效的藥物分子、提高藥物篩選和藥物設計的效率提供新的思路。
（一）現(xiàn)代分子生物學在研究基因表達和蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用中的局限性
現(xiàn)代分子生物學技術(shù)的迅速發(fā)展，特別是隨著后基因組時代的到來，人們已經(jīng)能夠根據(jù)需要建立各種細胞和動物模型，為在體研究基因表達規(guī)律、分子間的相互作用、腫瘤細胞的增殖、細胞信號轉(zhuǎn)導、誘導分化、細胞凋亡以及新的血管生成等提供了良好的生物學條件。
然而，盡管人們利用現(xiàn)有的分子生物學方法，已經(jīng)對基因表達和蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用進行了深入、細致的研究，但仍然不能實現(xiàn)對蛋白質(zhì)和基因活動的實時、動態(tài)監(jiān)測。在細胞的生理過程中，基因、尤其是蛋白質(zhì)的表達、修飾和相互作用往往發(fā)生可逆的、動態(tài)的變化。目前的分子生物學方法還不能捕獲到蛋白質(zhì)和基因的這些瞬時、動態(tài)、可逆的變化，但獲取這些信息對與研究基因的表達和蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)的相互作用又至關(guān)重要。因此，發(fā)展能用于活體、動態(tài)、實時、連續(xù)監(jiān)測蛋白質(zhì)和基因活動的方法非常必要。
光學成像技術(shù)與分子生物學技術(shù)的結(jié)合為研究上述科學問題提供了現(xiàn)實與可能。因此，在現(xiàn)代分子生物學技術(shù)基礎(chǔ)上，急需發(fā)展新的成像技術(shù)。在活體動物體內(nèi)，如何實現(xiàn)基因表達及蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用的實時在體成像監(jiān)測是當前迫切需要解決的重大核心科學技術(shù)問題！這是也生物學、信息科學（光學）和基礎(chǔ)臨床醫(yī)學等學科共同感興趣的重大基礎(chǔ)問題。對這一科學問題的研究不僅有助于闡明生命活動的基本規(guī)律、認識疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，而且對創(chuàng)新藥物研究、藥物療效評價以及發(fā)展疾病早期診斷技術(shù)（光子醫(yī)學診斷技術(shù)）等產(chǎn)生重大影響。
（二）基于分子光學標記的光學成像技術(shù)是重要的實時在體監(jiān)測手段
光學成像技術(shù)正成為實時在體研究分子間/分子內(nèi)蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用、離子通道、細胞膜蛋白及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導、生化底物及酶轉(zhuǎn)運等的重要手段，由于具有高時間、空間分辨率，比現(xiàn)有其他手段更為直接，因而可望成為后基因組時代新藥靶發(fā)現(xiàn)和高通量藥物篩選的新方法。
表1和表2分別給出了目前處于研究和應用階段的幾種主要成像技術(shù)的應用場合及參數(shù)比較。比較相關(guān)參數(shù)可以看出，基于分子光學標記的光學成像技術(shù)已經(jīng)在活體動物體內(nèi)基因表達規(guī)律方面展示了有較大的優(yōu)勢。
例如，正電子發(fā)射斷層成像（PET）可實現(xiàn)對分子代謝的成像，空間分辨率：1-2mm，時間分辨率：分鐘量級。與PET比較，光學成像的應用場合更廣（可測量更多的參數(shù)，請參見表1），且具有更高的時間分辨率（秒級），空間分辨率可達到微米。因此，二者比較，雖然光學成像在測量深度方面不及PET，但在測量參數(shù)種類與時空分辨方面有一定優(yōu)勢。對于小動物（如大鼠）研究來說，光學成像技術(shù)可以實現(xiàn)小動物整體成像和在體基因表達成像，例如，初步研究表明，熒光介導層析成像可達到近10cm的測量深度（Nature Reviews 2002）；基于多光子激發(fā)的顯微成像技術(shù)可望實現(xiàn)小鼠體內(nèi)基因表達的實時在體成像（Nature Medicine 2001）。
表1 主要成像技術(shù)及應用場合（Nature Reviews 2002）
成像方法 主要應用場合
磁共振成像（MRI） 高對比度，用于表型、生理成像和細胞跟蹤的最好的全方位成像系統(tǒng)。
計算機層析成像（CT） 肺和骨癌成像
超聲成像 血管和介入成像
正電子發(fā)射斷層成像PET 分子代謝，如葡萄糖，胸腺嘧啶核苷等的成像
單光子發(fā)射斷層成像SPECT 探針，如抗體，肽等的成像
熒光反射成像FRI 表面腫瘤分子事件的快速成像
熒光介導層析成像FMT 對深部腫瘤靶向標記或“靈活的”熒光染料標記進行定量成像
生物發(fā)光成像BLI 基因表達，細胞追蹤成像
活體顯微成像 以更高分辨率實現(xiàn)上述所有參數(shù)成像，但測量深度和范圍有限。
雖然在體光學成像技術(shù)在時/空分辨、實時、動態(tài)和多參數(shù)測量等方面有一定的優(yōu)勢，但仍然有大量的技術(shù)問題需要研究。例如，從光學標記角度看，如何針對所要研究的體系和對象，為實現(xiàn)在活細胞和動物體內(nèi)監(jiān)測基因表達及蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)的相互作用，發(fā)展特異性更高、更易于光學測量的核酸和蛋白質(zhì)探針，是當前要解決的關(guān)鍵技術(shù)問題之一。
表2 常用成像技術(shù)及參數(shù)比較（Nature Reviews 2002）
成像方法 空間分辨率 時間分辨率 測量深度 造影劑 價格
MRI 10-100m Min/hrs 無限制 釓，鏑和氧化鐵離子 $$$
CT 50m Min 無限制 碘 $$
超聲 50m Min mm 微型氣泡 $$
PET 1-2mm Min 無限制 18F，11C，15O $$$
SPECT 1-2mm Min 無限制 99mTc（亞穩(wěn)態(tài)锝）, 111In（銦） $$
熒光反射成像FRI 1-2mm Sec/min <1cm 熒光蛋白，近紅外熒光染料 $
熒光介導層析成像FMT 1-2mm Sec/min <10cm 近紅外熒光染料 $$
生物發(fā)光成像BLI 幾mm Min cm 螢光素 $$
活體顯微成像 1m Sec/min <400m 熒光蛋白，發(fā)光蛋白，近紅外熒光染料 $$$
其中：$表示價格<10萬美元；$$表示價格在10-30萬美元之間；$$$表示價格>30萬美元
表3簡要介紹了近幾年發(fā)展十分迅速、正受學術(shù)界高度關(guān)注的幾種研究活細胞內(nèi)基因表達與分子間相互作用動力學過程的光學成像技術(shù)的基本原理與特點，主要包括熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）、熒光壽命成像（FLIM）、熒光漂白后恢復（FRAP）、熒光漂白后定位（FLAP）、熒光關(guān)聯(lián)譜（FCS）和成像關(guān)聯(lián)譜（ICS）等。如何發(fā)展和整合相關(guān)的成像方法，并應用于在體成像，為基因表達和蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用研究提供更先進的手段，也應是本項目研究的關(guān)鍵技術(shù)問題。
在數(shù)據(jù)處理與可視化研究方面，也存在重大的科學問題。例如，對于600微米左右的熒光，雖然可以穿透較厚的組織而被探測到，但由于經(jīng)過了多次散射，如何定位發(fā)光位置，需要根據(jù)生物組織中的光子傳輸規(guī)律，通過圖像重建算法來實現(xiàn)，事實上這方面的研究已經(jīng)成為學術(shù)界的研究熱點。例如，基于成像測量（包括光學成像）的分子與細胞事件動力學過程的可視化研究被評為2002年Science的十大突破之一（Science, Dec.20, 2002）。
表3 活體細胞內(nèi)基因表達與分子間相互作用動力學過程的實時在體光學成像技術(shù)
名稱 原理與應用
熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET—Fluorescence Resonance Energy Transfer 供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過偶極子相互作用，實現(xiàn)了能量向鄰近的受體分子轉(zhuǎn)移。FRET可用于測量分子內(nèi)部間距，或蛋白質(zhì)的不同反應活性部位、模型系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)與脂質(zhì)、或細胞表面蛋白質(zhì)等分子之間的距離。即可測量分子間的接近度，距離，方位和動力學特性。由于FRET效率與供體受體間的距離成6次冪的關(guān)系，所以FRET效率對距離的變化非常靈敏，可以靈敏測量10Å-100Å范圍內(nèi)的距離變化。
熒光壽命成像FLIM—Fluorescence Lifetime IMaging 熒光壽命成像顯微鏡和壽命測量與熒光濃度或激發(fā)強度的變化無關(guān)，F(xiàn)RET與FLIM的結(jié)合可提供高的空間（納米）和時間（納秒）分辨率。通過供體壽命測量和處理時間分辯圖像，可精確計算相互作用的蛋白質(zhì)間的距離。由于只測量供體熒光壽命，在FRET—FLIM成像中，可不考慮光譜的交疊問題。
熒光漂白（后）恢復 FRAP—Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP是研究蛋白質(zhì)動力學的重要工具。在FRAP實驗中，利用激光脈沖有針對性對被熒光蛋白標記的細胞內(nèi)的一個小區(qū)域快速、不可逆地漂白。該漂白區(qū)域完全沒有熒光信號。然后使用延遲顯微鏡測量熒光信號隨時間的恢復情況。熒光的恢復是由未漂白的分子流入被漂白區(qū)域所造成的。因此熒光信號恢復的動力學過程含有了被標記蛋白的表觀遷移信息。
熒光漂白（后）定位 FLAP—Fluorescence Localization After Photobleaching FLAP是在活細胞內(nèi)對特定分子的光學標記進行定位和跟蹤的新方法。被定位的分子包括兩個熒光基團：一個被漂白，另一個則作為參考標記。與熒光漂白后恢復（FRAP）和熒光漂白中的損耗（FLIP）技術(shù)不同，利用參考熒光基團，通過簡單的圖像差異，即可跟蹤光學標記分子自身的分布。因此，F(xiàn)LAP實際上可與光敏化方法相對比。與籠鎖熒光探針方法相比，其主要優(yōu)點是可用于跟蹤細胞直接表達的嵌合熒光蛋白。
熒光關(guān)聯(lián)譜 FCS¬—Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS可用于分析小規(guī)模分子集合輻射行為所引起的微小的自發(fā)擾動，從而反映分子內(nèi)與分子間的動力學過程。由于FCS可觀察納摩爾（nanomolar）范圍的熒光分子，因而可在大的空間與時間范圍內(nèi)，非常近似地模仿不同過程中的實際生理條件，如結(jié)合與離解反應，生化底物的轉(zhuǎn)運、酶的周轉(zhuǎn)，分子內(nèi)（如結(jié)構(gòu)）的動力學過程等。FCS的時間分辨率也可以達到納秒（ns）量級。
成像關(guān)聯(lián)譜 ICS—Imaging Correlation Spectroscopy ICS為測量活細胞表面分子內(nèi)相互作用的動力學過程提供了一種新的方法，還可以幫助闡明細胞膜上蛋白質(zhì)的聯(lián)合是如何激活信號轉(zhuǎn)導通道的。ICS可測量分布在細胞表面的單個分子的密度、分子群、有組織的結(jié)構(gòu)或功能區(qū)。該技術(shù)可探測單個分子的空間分辨率約為200平方微米。由于與分子的總數(shù)目有關(guān)，因此可用于估計單分子實體（molecular entity）中的平均分子數(shù)目。
國際同行對動物活體內(nèi)基因表達與蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用的在體光學成像研究也非常重視。例如，美國NIH已經(jīng)召開過三次研討會，認為新的在體生物光子學方法可用于癌癥和其它疾病的早期檢測、診斷和治療。新一代的在體光學成像技術(shù)正處在從實驗室轉(zhuǎn)向癌癥臨床應用的重要時刻。在NIH的支持下，NCI（美國國家癌癥研究所）正在計劃5年投資1800萬美元，招標建立“在體光學成像和/或光譜技術(shù)轉(zhuǎn)化研究網(wǎng)絡（NTROI）”，其研究內(nèi)容主要包括：光學成像對比度的產(chǎn)生機理、在體光學成像技術(shù)與方法、臨床監(jiān)測、新光學成像方法的驗證、系統(tǒng)研制與集成等五個方面。美國NIH于2000年底成立了的國家生物醫(yī)學影像與生物工程研究所（NIBIB）,在其首批支持的項目中，光學成像方法約占30%。2000年7月，美國NIH投資2000萬美元，開展小動物成像方法項目（SAIRPs）研究，受到生命科學界的高度關(guān)注，其中光學成像方法也是其中的研究重點之一。NSF 在2000-2002年發(fā)布了四次Biophotonics Partnership Initiative 招標指南，呼吁開展多學科的合作研究。
（三）研究熱點與發(fā)展趨勢
從前面的討論中可以看出，研究熱點與發(fā)展趨勢應包括如下三個方面：
1. 生物分子的光學標記新技術(shù)研究。針對所研究的體系和對象，發(fā)展具有高度特異性的、可用于生物體內(nèi)活體成像的核酸和蛋白質(zhì)探針。例如研制新的發(fā)光蛋白用于動物模型體內(nèi)，實現(xiàn)蛋白質(zhì)在動物體內(nèi)的表達成像研究；設計并合成新型的具有高特異性的核酸探針，實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的活體監(jiān)測；發(fā)展在活體細胞內(nèi)監(jiān)測蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)的相互作用的新方法；發(fā)展新的表面修飾和標記方法，將熒光納米顆粒作為探針，用于活體細胞和動物器官的基因表達和蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)實時在體光學成像研究。
2. 在體光學成像新技術(shù)與應用研究。針對不同的研究對象和應用目標，發(fā)展各種新型的在體光學成像技術(shù)。例如實現(xiàn)小動物體內(nèi)深部目標探測的擴散光學成像方法；實現(xiàn)動物體內(nèi)藥代動力學和藥理學過程的實時在體成像監(jiān)測的相干域光學成像方法；實現(xiàn)對動物體內(nèi)基因表達和分子間相互作用過程在體成像監(jiān)測的多光子熒光等非線性光學成像方法；實現(xiàn)不同層次多參數(shù)測量的集成化在體光學成像系統(tǒng)；以及無須外源性標記的各類在體功能成像方法等。應用研究包括：a) 以小動物為研究對象，在動物體內(nèi)不同部位（如肺、肝、腦等）的腫瘤模型或其它疾病模型基礎(chǔ)上，研究在體基因表達規(guī)律，監(jiān)測腫瘤發(fā)生發(fā)展的動力學過程；對活體動物體內(nèi)分子與細胞事件進行定量成像研究，例如通過熒光標記蛋白的互補與重組策略，結(jié)合生物發(fā)光光學成像技術(shù)，可以實現(xiàn)對活體內(nèi)蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用的定量無損成像，從而有望提供一種有潛在價值的工具，對研究處于自然在體狀態(tài)環(huán)境下的細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用、對以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)相互作用為靶標的新藥的在體評估都具有非常重要的意義。動物組織、器官到整體水平的在體光學成像可望為研究藥物作用靶點和評價藥物作用效果提供重要技術(shù)手段。b) 以小動物體內(nèi)的活細胞為研究對象，用光學成像技術(shù)，實時在體研究細胞內(nèi)基因表達與分子間相互作用的動力學過程。例如，可文中提到的FRET、FLIM、FRAP、FLAP等技術(shù)研究蛋白質(zhì)分子間的相互作用、計算蛋白質(zhì)間的作用距離、特定分子在細胞內(nèi)移動、定位與跟蹤，以及蛋白質(zhì)的構(gòu)像變化等；運用FCS技術(shù)，在較大的空間與時間范圍內(nèi)，研究不同分子的結(jié)合與離解反應，生化底物的轉(zhuǎn)運、酶的周轉(zhuǎn)，以及分子內(nèi)（如結(jié)構(gòu)）變化的動力學過程等；運用ICS技術(shù)研究活細胞表面分子內(nèi)相互作用的動力學過程，研究細胞膜蛋白的聯(lián)合及其與信號轉(zhuǎn)導通道的激活關(guān)系等。
3. 數(shù)據(jù)處理、圖像重建與可視化方法研究。在光學成像檢測的基礎(chǔ)上，還需要開展數(shù)據(jù)處理、圖像重建與可視化方法研究。主要是根據(jù)光子傳輸規(guī)律和光學檢測模式，對所獲得的數(shù)據(jù)進行處理和可視化研究。
三、醫(yī)學光學成像技術(shù)
醫(yī)學光學成像技術(shù)從理論上可分為擴散光學成像與相干域光學成像，前者成像深度較深，理論基礎(chǔ)是光子輸運方程的擴散近似，被檢測的光學信號會在組織體內(nèi)經(jīng)歷多次散射，如何建立散射信息與組織光學特性參數(shù)變化間的關(guān)系和提取散射信息是其關(guān)鍵；后者成像深度主要在組織淺層，散射影響較小，如何避免散射和在強散射背景中提取有用的結(jié)構(gòu)與功能信息是其關(guān)鍵。
四、結(jié)論
生物醫(yī)學光學是新興交叉學科。光學技術(shù)為揭示生命活動的基本規(guī)律、臨床醫(yī)學診斷與治療提供了新的技術(shù)手段和方法，同時，生命科學的發(fā)展，也不斷對光學技術(shù)提出新的要求，促進了光學技術(shù)的發(fā)展。
作者簡介
駱清銘 博士，1966年1月生，教育部“長江學者獎勵計劃”特聘教授（首批），生物醫(yī)學光子學教育部重點實驗室主任，華中科技大學生命科學與技術(shù)學院院長。
現(xiàn)任國家863計劃生物信息技術(shù)主題管理專家，中國光學學會激光醫(yī)學分科學會主任委員，國際《生物醫(yī)學光學》(Journal of Biomedical Optics)雜志編委，《光電子•激光》雜志常務副主編，《激光生物學報》和《中國激光醫(yī)學雜志》副主編，《Chinese Optics Letters 中國光學快報》、《紅外與毫米波學報》，《中國醫(yī)療器械雜志》，《航天醫(yī)學與醫(yī)學工程》等雜志編委，《國外醫(yī)學—生物醫(yī)學工程分冊》特邀編輯。
五次擔任本學科國際會議主席，兩次應邀擔任香山科學會議執(zhí)行主席。
主持完成國家自然科學基金3項（其中重點項目1項，負責60%）；主持NSFC在研項目3項（含國家杰出青年科學基金），973前期研究專項1項。主持其它省部級以上項目5項。
獲國外專利4項，申請國內(nèi)專利5項；主編/參編專著5部（其中4部國外出版）；發(fā)表正式學術(shù)期刊論文80余篇，其中SCI、EI收錄超過60篇。
曾獲霍英東青年教師教學獎、中國青年科技獎、全國優(yōu)秀科技工作者等稱號。
工作單位：武漢 華中科技大學生命科學與技術(shù)學院
電話：027 8754 4624， 傳真：027-87542341
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