體內熒光成像技術的最新進展

體內熒光成像技術利用一架靈敏的照相機，檢測活的整體小動物熒光團的熒光發射，從而獲得清晰的圖像。為了克服活組織的光子衰減，通常優先選取近紅外區(NIR)的長波發射熒光團，包括廣泛應用的小分子靛炭菁染料。NIR探針的數目最近隨著有機、無機和生物熒光納米顆粒的采用而不斷增加。在體內熒光成像領域，成像策略和報道基因技術方面的最新進展包括一些改善探針特異性和親和性的新技術以及調制和放大高靈敏靶點區域信號的新方法。其他方面的進展還包括旨在獲得高分辨率、多峰形性和基于熒光壽命的體內熒光成像技術，等等。

導言
體內熒光成像技術類似于熒光顯微鏡，它們都使用一架低光度照相機和適當的濾光片，用以收集樣品的熒光發射光。兩者的不同點在于，前者是在一個肉眼可見的水平上進行操作，成像的對象是整體的小動物，而不是培養皿或載片上的細胞，由于延伸到體內環境，便可以從整體上展示完整的自然狀態下的生物。但是，體內熒光成像至少在兩個方面遭遇到技術上的挑戰。首先，厚而不透明的動物組織可以吸收或者衍射光子，產生強烈的自體熒光，所有這些都會使信號收集和測量變得模糊不清。其次，復雜的體內環境需要額外的造影劑或成像探針，而且這種造影劑或探針一旦分布于生物體內，必須具備生物穩定性，并且最好能優先累積于待測的靶點部位，產生此靶點特異的成像造影。
在描述組織光子傳播的數學模式以及在探照和檢測的儀器方面，過去已經取得明顯進展，提高了組織定量熒光成像的性能，對此已有評述。所以，本文無意對體內成像技術所有方面作詳盡的討論，只想重點討論成像探針化學和報道基因技術方面的最新進展。

熒光成像探針
在近紅外區域(NIR，即700~1000 nm）具有光吸收的分子，可以有效地用于顯示和調查體內分子靶點，因為大多數組織很少會產生NIR熒光。最常用的有機NIR熒光團是聚甲炔類化合物，其中戊甲炔-和庚甲炔青色素，包括苯并、苯并噻唑、吲哚基、2-喹啉或4-喹啉等，最為有效。最近有兩篇綜述對它們的物理性質、生物分布、藥物動力學和在體內熒光成像中的應用等進行了總結。
有一種新類型的體內熒光成像探針正在脫穎而出，這就是半導體納米晶體或量子點。典型的量子點(QDs)有一個直徑為2~8 nm的核/殼結構，熒光發射強度依賴于直徑的大小。QDs對于體內光學成像來說有著得天獨厚的光學特點，這就是吸收性高、量子產量高、發射譜帶窄、斯托克司頻移大以及光褪色抗性強等。能夠發射不同波長光譜的QDs可以為單一波長所激發，因此對于在一個實驗中檢測多靶點來說頗為適合。最近已有數篇綜述對 QDs的合成、生物結合的化學、光學特性以及在體內成像中的應用進行了總結。設計熒光成像探針的一般策略可以粗略地分為非定靶探針與定靶探針兩類。定靶探針又可細分為活性探針和可激活探針兩組。

非定靶探針
吲哚花青綠是一種非定靶NIR探針，目前在臨床上多用于測試血流和血液清潔度。此外， QDs也用作非定靶探針，而且業已表明它們是頗為有用的造影劑，在成年大白鼠脈管系統成像實驗中就是如此。根據這一思路，Kim等制備了II型QDs，它們具有新奇的核/殼結構（即大多數電子囿于殼上，而在核中卻呈空洞），在850 nm處有較寬的發射譜帶，它們已成功地用于小白鼠和豬的防御淋巴結的成像實驗。

活性定靶探針
改善靶點部位造影劑積累的通用而簡單的方法，是將熒光色素同能結合某一特異分子靶點（活性探針）的配體相耦合。該探針能結合到并停留在靶點部位，而非結合的探針則在循環中被清除。這種方法對于腫瘤的成像最為有用，因為癌癥往往使得某些表面受體超表達。
配體可以是小分子、多肽、蛋白質和抗體。例如Tung等利用葉酸受體在被激活的、非靜止的滑膜巨噬細胞上的表達，合成了一種葉酸-NIR熒光色素耦合體(NIR2-folate)，用于與結締組織炎癥有關的活化巨噬細胞的成像實驗。NIR熒光色素也用于成鼠腫瘤的體內成像實驗，在此例中，對內皮細胞增生有高度特異性的血管內皮抑素（endostatin，一種血管生成內源抑制劑）被標記。另一個例子是膜聯蛋白(Annexin V)，科學家用花青素染料對它進行標記，以便攝制凋亡細胞中磷酰絲氨酸的影像。用活性探針對活動物造骨活動的熒光成像實驗也取得成功，此探針是四磺酸庚次甲基吲哚花青素，它與結合了羥基磷灰石的配體帕米膦酸鹽相耦合。報道表明，在體內腫瘤成像中，花青素染料和QDs同單克隆抗體和單鏈抗體部分都可以耦合在一起。

可激活定靶探針
可激活定靶探針一般用于酶活的功能成像。它們往往含有兩個以上的等同或不同的色素團，兩個色素團通過酶特異性多肽接頭彼此緊密相連。這類探針主要呈黑色，沒有或者很少發射熒光，這主要是由于非常相近（等同色素團）或者共振能的轉移(不同色素團 )所造成的淬滅效應所致。多肽接頭的切除，使它們的熒光團釋放出來，熒光發射于是得以恢復。因此，可激活探針的背景信號通常很低，但造影和檢測的靈敏性卻高于活性探針。一些可激活探針見于本文文獻和某些綜述。酶靶點主要限于蛋白酶，包括組織蛋白酶、半胱氨酸天冬氨酸特異蛋白酶、基質金屬蛋白酶、凝血酶、HIV 和 HSV蛋白酶以及尿激酶類血纖維蛋白溶酶原激活劑，等等

新熒光探針
小有機熒光團
化學家不斷地研發著具有改良的熒光量子產量、高化學和光學穩定性、低聚合性和低細胞毒性的新NIR熒光色素。例如，Dehaen等利用鈀催化的偶聯反應合成了數個BODIPY衍生物，發射光范圍從綠色到近紅外不等。Zhao等報道了有一定構象的Aza-BOBIPY染料，它們的物理性質和化學與光學穩定性都得到改進。Tung等設計了一系列Nile藍類似物，其激發光與發射光分別為640 nm和680nm 。這些小分子有機染料對于體內成像實驗的功效尚需經過評定。Gremlich等所描述的NIR熒光嗪染料AOI987在血清中的最大發射光在670 nm，最大激發光在650 nm。AOI987可以穿透整個血腦屏障，故可用于轉基因小白鼠中淀粉塊的成像實驗。

有機熒光納米顆粒
目前已經研發出一大類用于藥物傳送的有機納米顆粒，諸如脂質體、樹枝狀納米體、聚合物納米體等，這些也可用于體內光學成像。Therien 等通過兩性雙嵌段共聚物(diblock copolymer) 的自身互相聚合，合成了NIR-可發射聚合體（聚合體球的直徑在50 nm~50 μm之間），并將這些聚合體耦合到多（卟啉）NIR熒光團上。樹枝狀納米體以前用作核磁共振成像(MRI)造影劑的載體，現在McIntyre等設計出一種以聚酰胺樹枝狀納米體為基礎的熒光底物，用以對腫瘤基質金屬蛋白酶-7進行體內成像實驗。業已表明，一種標以脈管內皮細胞生長因子(VEGF)和NIR染料Cy5的硼酸鹽樹枝狀納米體，可以選擇性地同小白鼠乳腺癌失調的VEGF受體相結合。

熒光生物納米顆粒
當多種熒光染料附著于同一分子（例如抗體）時，由于各種染料之間的淬滅效應，熒光強度反而會減弱，而不會增強。但是，如果用病毒外殼當標記的支撐架，則40多種Cy5染料便可以通過特殊的化學耦合作用加載于單一病毒顆粒上，由于分子間的距離較大，所以觀察不到熒光淬滅。通過這種方法就可以合成具有一定結構的、直徑在30 nm左右的強熒光納米顆粒，這種染料的局部濃度可以高達1.8 mM而無淬滅發生。標以Alexa染料的豇豆花葉病毒已經成功用以顯示脈管系統和血流，而且用于在活小白鼠和雞胚中人纖維肉瘤造成的腫瘤血管發生等情況。

自我發光的無機納米顆粒
QDs的熒光發生需要外部光源的激發，這就限制了它們在活的不透明物質成像中的應用，其原因是，產生的熒光背景很強，而且在非表面部位有少量激發光。為了克服這些困難，我們設計了一種新類型QDs耦合體，它們能發光而無需外部激發。通過將羧酸鹽QDs耦合于生物發光蛋白質海腎(Renilla)螢光素酶突變體的辦法，就可以制備出這些自我發光的QD耦合體。熒光素酶對底物分解所釋放出的能量，可以通過共振能量轉移而傳給QDs，導致QD光發射。這些自我發光的QD耦合體可以在活細胞和活動物中發出長波（從紅光到近紅外光）生物照明光，即使在深層組織中也如此，而且可以應用于多路體內成像。由熒光素酶與其他蛋白質的融合物（融合蛋白）也可獲得相似的自我發光的QD耦合體，這有可能導致活生物其他生物活動的成像方法的出現。

成像新策略的出現
改進探針親和性的多種途徑
探針同靶點的緊密和特異性結合通常是成像成功的關鍵。因為許多成像靶點都位于細胞表面之外，所以多途徑原則可以用來改善探針的結合親和性。最近有兩篇文獻報道了用于異種移植腫瘤αvβ3 整合素（integrin）體內成像的RGD（Arg-Gly-Asp ）寡肽的設計。Cheng等合成了單體、二體和四體環RGD，并將它們耦合于Cy5.5，用于活小白鼠的腫瘤成像實驗。Cy5.5-RGD 四體表現出最高的腫瘤吸收活性和最高的腫瘤-本底熒光比。Ye等對完整小白鼠中的線形多體RGD–cypate（一種近紅外碳花青素分子探針）耦合物的內在化和定位進行了監控，發現αvβ3 整合素受體結合親和性和腫瘤吸收依賴于多價RGD成分的數目和空間排布。

尋找新探針的噬菌體文庫篩選法
對系統的分子庫篩選策略的研究已有很長時間，這類研究的目的是鑒定靶點特異性抑制劑和先導藥物，最近已把此類研究延伸到分子成像領域。Newton等用體內噬菌體顯示和micropanning分析（微篩法，噬菌體捕獲分析）在小白鼠中選擇能夠溢出和結合人PC-3前列腺癌異種移植物的噬菌體，以用于體內成像的近紅外染料AlexFluor 680對鑒定出的噬菌體克隆進行標記，結果顯示，此克隆表現出高腫瘤-肌肉熒光比。組合化學法也用于篩選具有高親和性的擬肽配體(LLP2A)探針。Peng等提出用于活細胞篩選的一珠一化合物的組合文庫法，成功地鑒定出一種新的擬肽配體(LLP2A)，該配體以高親和性和特異性結合于αvβ3 整合素，可用于αvβ3 整合素體內腫瘤NIR成像。

可激活活性探針
活性探針能產生反差，這一結果是通過將探針保持在靶點部位、并且迅速從血液循環和非定靶部位清除造成的。對于高分子量的探針來說，這一清除過程非常緩慢。一個只有結合到靶點才能激發出熒光的探針，有望克服這一困難。最近Swager等設計出一種NIR染料，叫NIAD-4，它能跨越血腦屏障，特異地檢測轉基因小白鼠腦中的類淀粉-β沉積物。與以前述及的AIO987不同，NIAD-4當結合于凝集的類淀粉纖維時，它在610 nm 的熒光發射增加了400倍。Weissleder等報道指出，一種遠紅外吲哚花青素類熒光團，當結合于白蛋白時，熒光發射顯著提高，因此適宜于用熒光分子斷層掃描特異顯示體內腫瘤組織。應用靶點激活的小分子熒光色素，是一種非常有用的細胞內靶點成像途徑，因為造影機制并不依賴于探針是否快速從循環和非靶點部位清除。

探針的酶促攝入
Tsien等設計了一個酶促“認門”策略，借此選擇性地將成像探針準確無誤地輸送到靶細胞。可激活探針由兩個片段組成，一是為某一NIR染料所標記的能穿透細胞的多陽離子肽(CPP)；一是能夠阻遏被CPP誘發的細胞攝入的多陰離子封堵肽。這兩部分通過對基質金屬蛋白酶-2（一種在腫瘤中高度表達的酶）敏感的多肽接頭而連接在一起。此探針一經到達腫瘤部位，接頭便被蛋白水解酶降解掉，釋放出被標記的CPP部分，繼而發生細胞移位。報道探針在靶點細胞中的積累，原則上可以導致信號放大和靈敏性提高。這種成像策略在體內已被證明是成功的，它能顯示小白鼠纖維肉瘤細胞和植入的人鱗狀上皮細胞瘤組織。我們最近證明，這一策略同樣可用諸如QDs一類納米顆粒來做。

基于連接的探針
以蛋白質活性為基礎的蛋白質組學圖式是應用熒光標記蛋白質底物或抑制劑而作出的，底物或抑制劑能同靶點酶形成共價加合物。 Blum 等最近把這一策略應用到體內蛋白酶成像研究。他們的設計以半胱氨酸蛋白酶可以被酰氧甲酮共價抑制為依據，所用的探針是連接于淬滅劑酰氧基離去基團的熒光色素標記肽。在蛋白酶存在下，此探針就會發熒光，并且以共價鍵結合于酶上。雖然這一設計已經證明在活細胞中有效，但在體內實驗中的效用仍待測試。

新報道基因技術
紅和近紅外熒光蛋白質
所謂報道技術就是應用報道基因作為必要工具研究基因表達和調節的技術。體內成像應用的報道基因有幾種，其中編碼熒光蛋白(FPs)的基因仍然最為常見，因為這些蛋白質有其遺傳編碼，易于應用，無需系統傳送成像探針。在癌癥研究中，以熒光蛋白為基礎的體內成像，可以用來直接顯示原始腫瘤的生長、侵染、轉移擴散、腫瘤血管生成以及腫瘤與周圍環境的相互作用。最先發現的FP是水母中的綠色熒光蛋白，其后利用遺傳工程創造出許多突變體，所以熒光發射范圍很廣。Tsien等經過多次體細胞超突變結合熒光活化細胞計數，產生出具有紅和近紅外熒光(648 nm)發射的熒光蛋白質變體，這些新的熒光蛋白質變體極大地克服了熒光顏色選擇的限制，更適合于體內熒光成像研究。

β-半乳糖苷酶
β-半乳糖苷酶(β-gal)是另一種常用的報道蛋白，它能產生多種可被檢測的熒光和顏色。例如，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷(X-gal)通常用于β-gal基因表達的成色鑒定；而熒光素雙-β-d-半乳糖苷酶(FDG)則可用于活細胞成像。此外，據最近報導，其改良低物TG-βGal可用于單相動力學活細胞成像，而且優于FDG。為了把β-gal的離體和活細胞成像方面的應用擴展到體內成像領域，Tung等發現，一種先前用到的底物吡喃半乳糖糖苷衍生物(DDAOG)可以用來顯示活小白鼠中β-gal的表達。DDAOG被β-gal切割后，可以釋放出熒光團DDAO，后者最大的發光波長在659 nm處，比DDAOG向紅光方向移動了50 nm。然而，DDAO的發射光譜同其激發光譜離得很窄，這就明顯地限制了這一報道蛋白的靈敏性。另一個重要發展是β-gal體內成像中報道蛋白-酶循序技術，它極大地提高了β-gal報道蛋白的靈敏度。Blau等利用具有體內高度靈敏性的生物發光報道蛋白螢火蟲熒光素酶(FLuc)，并將它同叫做d-蟲熒光素-d-半乳糖苷輔劑(Lugal)的商品底物結合在一起，用于β-gal的體內成像。β-gal先對Lugal進行切割，釋放出d-蟲熒光素，d-蟲熒光素再經FLuc氧化而產生光。最近這些改進使得β-Gal成為集離體、細胞培養和體內成像大成的單一報道蛋白。

β-內酰胺酶
TEM-1β-內酰胺酶(Bla)是一小分子量(29 kDa)的細菌單體酶，它是另一常用的報道蛋白，已廣泛地用于生物學過程以及哺乳動物組織培養活細胞相互作用的檢測和成像。例如，用Bla研究啟動子和調節子的活性等，因為它可以顯示RNA拼接、監測病毒感染、檢測蛋白質之間的相互作用以及展示細胞表面蛋白水解酶的水解活性等，有關的熒光原底物多有報道。最近，我們設計了用于活細胞中Bla成像的細胞穿透性NIR 熒光原底物，我們用了一對熒光共振能量轉移(FRET)體Cy5-QSY21。底物頭孢菌素在7-氨基處連接于 NIR熒光團Cy5，同時在3′端連接于淬滅劑QSY21。此探針還連接了一個d-氨基葡萄糖類似物，以幫助細胞攝入活動。培養物中表達Bla的C6細胞可以用此探針進行成像。此外，科學家還對此探針進行了修飾，成功地對活小白鼠中C6神經膠質瘤進行成像。
生物素-鏈霉抗生物素蛋白相互作用介導的受體成像
與上述的三種光學報道蛋白系統相反，一種基于生物素-鏈霉抗生物素蛋白緊密相互作用的受體成像新技術，已被Tannous等用于培養物和體內報道蛋白標記細胞的成像。這種報道蛋白是一種重組膜蛋白(BAP-TM)，它含有一生物素受體肽(BAP)。BAP可以被內源的生物素連接酶加上生物素而被“生物素化”，隨后將被標記的鏈霉抗生物素蛋白注入，以便選擇性地結合生物素化的報道蛋白。這種通用的技術可以用于其他形式的體內成像，例如核磁共振成像等。

新趨勢
高分辨率體內成像
體內熒光成像技術與熒光顯微鏡不同之處在于，它所檢測的是細胞群的大宗信號，但分辨率較低。與此相反，熒光顯微內鏡應用小光學探針（一般直徑為0.25–1 mm），將它們以最小損傷的方法插入固體組織中，達到組織深層高分辨成像的目的。這種技術與熒光探針相結合，可以在單細胞和單分子水平上檢測活組織的生物活動。

多峰形性成像
體內熒光成像與核磁共振、X光計算機斷層掃描(CT)一類剖視性成像互相配合，可以提供互補信息，克服熒光成像的缺陷，諸如光子對組織穿透性受限制以及三維空間分辨率低下等。多功能探針的研發日益受到關注，已經浮現出一些新技術研究，包括基于離子氧化物和樹枝體的雙MRI–熒光成像造影劑、 X光計算機斷層掃描(CT)-熒光成像融合技術系統等。

熒光壽命成像
目前大多數體內成像研究都局限于測量熒光強度的變化。但是，熒光壽命成像(FLIM)與光強度測量不同，它對探針局部濃度的依賴性小，從固有特性看，只要有光吸收和散射，它就能“大顯身手”，雖然它對環境的變化十分敏感。近來，有些學者通過發展三維熒光壽命掃描成像以及用NIR肽探針對腫瘤異種移植進行成像的途徑，開始研究在活的小動物中利用整體FLIM的問題。

結論
體內熒光成像技術可以展示整體活的小動物中熒光團的熒光發射狀況。利用日臻完善的熒光探針和報道蛋白，這種技術正在成為探索基礎研究和臨床應用之間聯系的重要紐帶。傳統的小分子NIR染料雖然繼續被使用，但是用于體內熒光成像的有機、生物和無機的熒光納米顆粒卻提供了更有力的工具，在許多應用方面令人驚嘆不已。這些納米顆粒可以用作構建適合于多態成像的多功能探針。成像策略和報道蛋白技術的創新，定會極大地改進探針的特異性和靈敏度。基于高分辨率和熒光壽命的體內熒光成像的進展，可能會進一步增強成像技術的性能。這些新技術持續不斷的進步，一定會有更多的分子靶點和疾病被成功探測出來。

作者：文/Jianghong Rao 譯/魏榮瑄