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技術(shù)原理 |
技術(shù)應(yīng)用 |
常見(jiàn)問(wèn)題解答 |
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活體動(dòng)物體內(nèi)光學(xué)成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物發(fā)光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）兩種技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶(Luciferase)基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，而熒光技術(shù)則采用熒光報(bào)告基團(tuán)（GFP、RFP, Cyt及dyes等）進(jìn)行標(biāo)記。利用一套非常靈敏的光學(xué)檢測(cè)儀器，讓研究人員能夠直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)和基因行為。通過(guò)這個(gè)系統(tǒng)，可以觀測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移、感染性疾病發(fā)展過(guò)程、特定基因的表達(dá)等生物學(xué)過(guò)程。傳統(tǒng)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法需要在不同的時(shí)間點(diǎn)宰殺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以獲得數(shù)據(jù), 得到多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。相比之下，可見(jiàn)光體內(nèi)成像通過(guò)對(duì)同一組實(shí)驗(yàn)對(duì)象在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行記錄，跟蹤同一觀察目標(biāo)（標(biāo)記細(xì)胞及基因）的移動(dòng)及變化，所得的數(shù)據(jù)更加真實(shí)可信。另外, 這一技術(shù)對(duì)腫瘤微小轉(zhuǎn)移灶的檢測(cè)靈敏度極高，不涉及放射性物質(zhì)和方法, 非常安全。 因其操作極其簡(jiǎn)單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高等特點(diǎn), 在剛剛發(fā)展起來(lái)的幾年時(shí)間內(nèi)，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物開(kāi)發(fā)等方面。 |
1. 標(biāo)記原理
哺乳動(dòng)物生物發(fā)光，是將Fluc基因整合到細(xì)胞染色體DNA上以表達(dá)熒光素酶，當(dāng)外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素(luciferin)，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP及氧氣的存在條件下，催化熒光素的氧化反應(yīng)才可以發(fā)光，因此只有在活細(xì)胞內(nèi)才會(huì)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且光的強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目線性相關(guān)。對(duì)于細(xì)菌，lux操縱子由編碼熒光素酶的基因和編碼熒光素酶底物合成酶的基因組成，帶有這種操縱子的細(xì)菌會(huì)持續(xù)發(fā)光，不需要外源性底物。
基因、細(xì)胞和活體動(dòng)物都可被熒光素酶基因標(biāo)記。標(biāo)記細(xì)胞的方法基本上是通過(guò)分子生物學(xué)克隆技術(shù), 將熒光素酶的基因插到預(yù)期觀察的細(xì)胞的染色體內(nèi)，通過(guò)單克隆細(xì)胞技術(shù)的篩選, 培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株。將標(biāo)記好的細(xì)胞注入小鼠體內(nèi)后, 觀測(cè)前需要注射熒光素酶的底物—熒光素，為約280道爾頓的小分子。熒光素脂溶性非常好, 很容易透過(guò)血腦屏障。注射一次熒光素能保持小鼠體內(nèi)熒光素酶標(biāo)記的細(xì)胞發(fā)光30-45分鐘。每次熒光素酶催化反應(yīng)只產(chǎn)生一個(gè)光子，這是肉眼無(wú)法觀察到的，應(yīng)用一個(gè)高度靈敏的 VERSARRAY 1300B制冷CCD相機(jī)及特別設(shè)計(jì)的成像暗箱和成像軟件，可觀測(cè)并記錄到這些光子。
2. 光學(xué)原理
光在哺乳動(dòng)物組織內(nèi)傳播時(shí)會(huì)被散射和吸收，光子遇到細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)時(shí)會(huì)發(fā)生折射現(xiàn)象，而且不同類型的細(xì)胞和組織吸收光子的特性并不一樣。在偏紅光區(qū)域, 大量的光可以穿過(guò)組織和皮膚而被檢測(cè)到。利用靈敏的活體成像系統(tǒng)最少可以看到皮下的500個(gè)細(xì)胞，當(dāng)然，由于發(fā)光源在老鼠體內(nèi)深度的不同可看到的最少細(xì)胞數(shù)是不同的。在相同的深度情況下, 檢測(cè)到的發(fā)光強(qiáng)度和細(xì)胞的數(shù)量具有非常好的線性關(guān)系。可見(jiàn)光體內(nèi)成像技術(shù)的基本原理在于光可以穿透實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的組織并且可由儀器量化檢測(cè)到的光強(qiáng)度，同時(shí)反映出細(xì)胞的數(shù)量。
3. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程
通過(guò)分子生物學(xué)克隆技術(shù), 應(yīng)用單克隆細(xì)胞技術(shù)的篩選，將熒光素酶的基因穩(wěn)定整合到預(yù)期觀察的細(xì)胞的染色體內(nèi)，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶蛋白的細(xì)胞株。
典型的成像過(guò)程是：小鼠經(jīng)過(guò)麻醉系統(tǒng)被麻醉后放入成像暗箱平臺(tái)，軟件控制平臺(tái)的升降到一個(gè)合適的視野，自動(dòng)開(kāi)啟照明燈拍攝第一次背景圖。下一步，自動(dòng)關(guān)閉照明燈, 在沒(méi)有外界光源的條件下拍攝由小鼠體內(nèi)發(fā)出的光，即為生物發(fā)光成像。 與第一次的背景圖疊加后可以清楚的顯示動(dòng)物體內(nèi)光源的位置，完成成像操作。之后，軟件完成圖像分析過(guò)程。使用者可以方便的選取感興趣的區(qū)域進(jìn)行測(cè)量和數(shù)據(jù)處理及保存工作。當(dāng)選定需要測(cè)量的區(qū)域后，軟件可以計(jì)算出此區(qū)域發(fā)出的光子數(shù)，獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。軟件的數(shù)據(jù)處理和保存功能非常強(qiáng)大，可以加快實(shí)驗(yàn)速度，方便大批量的實(shí)驗(yàn)。
4．熒光成像功能
熒光發(fā)光是通過(guò)激發(fā)光激發(fā)熒光基團(tuán)到達(dá)高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生發(fā)射光。常用的有綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白DsRed 及其它熒光報(bào)告基團(tuán)，標(biāo)記方法與體外熒光成像相似。熒光成像具有費(fèi)用低廉和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。 同生物發(fā)光在動(dòng)物體內(nèi)的穿透性相似，紅光的穿透性在體內(nèi)比藍(lán)綠光的穿透性要好得多，近紅外熒光為觀測(cè)生理指標(biāo)的最佳選擇。
雖然熒光信號(hào)遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于生物發(fā)光，但非特異性熒光產(chǎn)生的背景噪音使其信噪比遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于生物發(fā)光。雖然許多公司采用不同的技術(shù)分離背景光，但是受到熒光特性的限制，很難完全消除背景噪音。這些背景噪音造成熒光成像的靈敏度較低。目前大部分高水平的文章還是應(yīng)用生物發(fā)光的方法來(lái)研究活體動(dòng)物體內(nèi)成像。 但是，熒光成像有其方便，便宜，直觀，標(biāo)記靶點(diǎn)多樣和易于被大多數(shù)研究人員接受的優(yōu)點(diǎn)，在一些植物分子生物學(xué)研究和觀察小分子體內(nèi)代謝方面也得到應(yīng)用。對(duì)于不同的研究，可根據(jù)兩者的特點(diǎn)以及實(shí)驗(yàn)要求，選擇合適的方法。最近許多文獻(xiàn)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)中，利用綠色熒光蛋白和熒光素酶對(duì)細(xì)胞或動(dòng)物進(jìn)行雙重標(biāo)記，用成熟的熒光成像技術(shù)進(jìn)行體外檢測(cè)，進(jìn)行分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究；然后利用生物發(fā)光技術(shù)進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)， 進(jìn)行活體動(dòng)物體內(nèi)研究。 |
通過(guò)活體動(dòng)物體內(nèi)成像系統(tǒng)，可以觀測(cè)到疾病或癌癥的發(fā)展進(jìn)程以及藥物治療所產(chǎn)生的反應(yīng)，并可用于病毒學(xué)研究、構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型、siRNA研究、干細(xì)胞研究、蛋白質(zhì)相互作用研究以及細(xì)胞體外檢測(cè)等領(lǐng)域。具體應(yīng)用如下：
1. 標(biāo)記細(xì)胞
（1） 癌癥與抗癌藥物研究
直接快速地測(cè)量各種癌癥模型中腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并可對(duì)癌癥治療中癌細(xì)胞的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)和評(píng)估。活體生物發(fā)光成像能夠無(wú)創(chuàng)傷地定量檢測(cè)小鼠整體的原位瘤、轉(zhuǎn)移瘤及自發(fā)瘤。活體成像技術(shù)提高了檢測(cè)的靈敏度，即使微小的轉(zhuǎn)移灶也能被檢測(cè)到（可以檢測(cè)到體內(nèi)102個(gè)細(xì)胞的微轉(zhuǎn)移）。
Senescence and tumour clearance is triggered by p53 restoration in murine liver carcinomas
Wen Xue1*, Lars Zender1*, Cornelius Miething1, Ross A. Dickins1,2, Eva Hernando3, Valery Krizhanovsky1,
Carlos Cordon-Cardo3 & Scott W. Lowe1,2
Although cancer arises from a combination of mutations in oncogenes and tumour suppressor genes, the extent to which tumour suppressor gene loss is required for maintaining established tumours is poorly understood. p53 is an important tumour suppressor that acts to restrict proliferation in response to DNA damage or deregulation of mitogenic oncogenes, by leading to the induction of various cell cycle checkpoints, apoptosis or cellular senescence1,2. Consequently, p53 mutations increase cell proliferation and survival, and in some settings promote genomic instability and resistance to certain chemotherapies3. To determine the consequences of reactivating the p53 pathway in tumours, we used RNA interference (RNAi) to conditionally regulate endogenous p53 expression in a mosaic mouse model of liver carcinoma4,5. We show that even brief reactivation of endogenous p53 in p53-deficient tumours can produce complete tumour
regressions. The primary response to p53 was not apoptosis, but instead involved the induction of a cellular senescence program that was associated with differentiation and the upregulation of inflammatory cytokines. This program, although producing only cell cycle arrest in vitro, also triggered an innate immune response that targeted the tumour cells in vivo, thereby contributing to tumour clearance. Our study indicates that p53 loss can be required for the maintenance of aggressive carcinomas, and illustrates how the cellular senescence program can act together with the innate immune system to potently limit tumour growth.。
（2） 免疫學(xué)與干細(xì)胞研究
將熒光素酶標(biāo)記的造血干細(xì)胞移植入脾及骨髓，可用于實(shí)時(shí)觀測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)干細(xì)胞造血過(guò)程的早期事件及動(dòng)力學(xué)變化。有研究表明，應(yīng)用帶有生物發(fā)光標(biāo)記基因的小鼠淋巴細(xì)胞，檢測(cè)放射及化學(xué)藥物治療的效果，尋找在腫瘤骨髓轉(zhuǎn)移及抗腫瘤免疫治療中復(fù)雜的細(xì)胞機(jī)制。應(yīng)用可見(jiàn)光活體成像原理標(biāo)記細(xì)胞，建立動(dòng)物模型，可有效的針對(duì)同一組動(dòng)物進(jìn)行連續(xù)的觀察，節(jié)約動(dòng)物樣品數(shù)，同時(shí)能更快捷地得到免疫系統(tǒng)中病原的轉(zhuǎn)移途徑及抗性蛋白表達(dá)的改變。
（3） 細(xì)胞凋亡
當(dāng)熒光素酶與抑制多肽以融合蛋白形式在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生的融合蛋白無(wú)熒光素酶活性，細(xì)胞不能發(fā)光，而當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，活化的caspase-3在特異識(shí)別位點(diǎn)切割去掉抑制蛋白，恢復(fù)熒光素酶活性，產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，由此可用于觀察活體動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞凋亡相關(guān)事件。也可以通過(guò)使用特殊的底物，DEVD-luciferin，當(dāng)發(fā)生細(xì)胞凋亡時(shí)，活化的caspase-3會(huì)切斷DEVD與luciferin的連接，恢復(fù)熒光素酶與luciferin的相互作用而發(fā)光。
2. 標(biāo)記病毒
（1） 病毒侵染
以熒光素酶基因標(biāo)記的HSV-1病毒為例，可觀察到HSV-1病毒對(duì)肝臟、肺、脾及淋巴結(jié)的侵和病毒從血液系統(tǒng)進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)的過(guò)程。多種病毒，腺病毒，腺相關(guān)病毒，慢病毒，乙肝病毒等，已被熒光素酶標(biāo)記，用于觀察病毒對(duì)機(jī)體的侵染過(guò)程。
（2） 基因治療
基因治療包括在體內(nèi)將一個(gè)或多個(gè)感興趣的基因及其產(chǎn)物安全而有效的傳遞到靶細(xì)胞。可應(yīng)用熒光素酶基因作為報(bào)告基因用于載體的構(gòu)建，觀察目的基因是否能夠在試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)持續(xù)高效和組織特異性表達(dá)。這種非侵入方式具有容易準(zhǔn)備、低毒性及輕微免疫反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)。熒光素酶基因也可以插入脂質(zhì)體包裹的DNA分子中, 用來(lái)觀察脂質(zhì)體為載體的DNA運(yùn)輸和基因治療情況。
Interrogating Androgen Receptor Function in Recurrent Prostate Cancer1,2
Liqun Zhang, Mai Johnson, Kim H. Le, Makoto Sato, Romyla Ilagan, Meera Iyer, Sanjiv S. Gambhir, Lily Wu, and Michael Carey3
Departments of Biological Chemistry [L. Z., K. H. L., R. I., M. C.] and Urology [M. J., M. S., L. W.], Crump Institute of Molecular Imaging [S. S. G., L. W., M. C.], and Department of Molecular and Medical Pharmacology [M. I., S. S. G.], University of California, Los Angeles, School of Medicine, Los Angeles, California 90095
ABSTRACT
The early androgen-dependent (AD) phase of prostate cancer is dependent on the androgen receptor (AR). However, it is unclear whether AR is fully functional in recurrent prostate cancer after androgen withdrawal. To address this issue we interrogated AR signaling in AD and recurrent prostate cancer xenografts using molecular imaging, chromatin immunoprecipitation, and immunohistochemistry. In the imaging experiments, an adenovirus bearing a two-step transcriptional activation cassette, which amplifies AR-dependent firefly luciferase reporter gene activity, was injected into tumors implanted into severe combined immunodeficiency mice. A charge-coupled device optical imaging system detected the initial loss and then resumption of AR transcriptional activity in D-luciferin-injected mice as tumors transitioned from AD to recurrent growth. The results of chromatin immunoprecipitation and immunohistochemical
localization experiments correlated with the Ad two-step transcriptional activation imaging signal. AR localized to the nucleus and bound to the endogenous prostate-specific antigen enhancer in AD tumors but exited the nucleus and dissociated from the enhancer upon castration. However, AR reentered the nucleus and rebound the prostate-specific
antigen enhancer as the cancer transitioned into the recurrent phase. Surprisingly, RNA polymerase II and the general factor TFIIB remained bound to the gene throughout the transition. Our data support the concept that AR is fully functional in recurrent cancer and suggest a model by which a poised but largely inactive transcription complex facilitates reactivation by AR at castrate levels of ligand
3. 標(biāo)記細(xì)菌
（1） 細(xì)菌侵染研究
可以用標(biāo)記好的革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌侵染活體動(dòng)物, 觀測(cè)其在動(dòng)物體內(nèi)的繁殖部位、數(shù)量變化及對(duì)外界因素的反應(yīng)。
（2） 抗生素藥物
利用標(biāo)記好的細(xì)菌在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)藥物的反應(yīng)，醫(yī)藥公司和研究機(jī)構(gòu)可用這種成像技術(shù)進(jìn)行藥物篩選和臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。
4. 基因表達(dá)和蛋白質(zhì)相互作用
（1） 組織特異性基因表達(dá)
熒光素酶(luciferase)是一類生物發(fā)光酶，其中的renilla熒光素酶和firefly熒光素酶分別識(shí)別不同的底物, 一種細(xì)胞可被這兩種熒光素酶標(biāo)記: renilla 熒光素酶基因由一組成性穩(wěn)定表達(dá)的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng), 作為內(nèi)參，反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量的變化; firefly熒光素酶基因由要研究的組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。這樣firefly熒光素酶發(fā)光信號(hào)的變化，在消除細(xì)胞數(shù)量變化的影響后就可反應(yīng)特定的啟動(dòng)子在動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)活性。
（2） 蛋白質(zhì)相互作用
觀察細(xì)胞中或活體動(dòng)物體內(nèi)兩種蛋白質(zhì)的相互作用，是將熒光素酶基因分成兩段，分別連接所研究的兩種蛋白之一的編碼DNA，然后導(dǎo)入細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)為融合蛋白。當(dāng)兩種蛋白有強(qiáng)相互作用時(shí)，表達(dá)的熒光素酶兩部分相互靠近形成有活性的熒光素酶，在有底物存在時(shí)出現(xiàn)生物發(fā)光，反映出所研究的兩種蛋白存在相互作用。應(yīng)用此原理亦可用于研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
（3） 阻斷RNA
通過(guò)對(duì)比生物發(fā)光的變化，驗(yàn)證在成年小鼠體內(nèi)，注射雙鏈siRNA可以特異地阻遏基因表達(dá)。
5. 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型
（1） 基因表達(dá)
為研究目的基因是在何時(shí)、何種刺激下表達(dá)，將熒光素酶基因插入目的基因啟動(dòng)子的下游，并穩(wěn)定整合于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染色體中，形成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。利用其表達(dá)產(chǎn)生的熒光素酶與底物作用產(chǎn)生生物發(fā)光，反應(yīng)目的基因的表達(dá)情況，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的研究。可用于研究動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中特定基因的時(shí)空表達(dá)情況，觀察藥物誘導(dǎo)特定基因表達(dá)，以及其它生物學(xué)事件引起的相應(yīng)基因表達(dá)或關(guān)閉。
（2） 各種疾病模型
研究者根據(jù)研究目的，將靶基因、靶細(xì)胞、病毒及細(xì)菌進(jìn)行熒光素酶標(biāo)記，同時(shí)轉(zhuǎn)入動(dòng)物體內(nèi)形成所需的疾病模型，包括腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、感染疾病等等。可提供靶基因在體內(nèi)的實(shí)時(shí)表達(dá)和對(duì)候選藥物的準(zhǔn)確反應(yīng)，還可以用來(lái)評(píng)估候選藥物和其它化合物的毒性。為藥物在疾病中的作用機(jī)制及效用提供研究方法。
6. 熒光成像功能
用RFP標(biāo)記病毒，動(dòng)態(tài)檢測(cè)病毒在體內(nèi)的復(fù)制過(guò)程。
例：In vivo Near-Infrared Fluorescence Imaging of Integrin _v_3 in Brain
Tumor Xenografts
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| 》活體動(dòng)物體內(nèi)成像技術(shù)常見(jiàn)問(wèn)題解答 |
| 關(guān)于細(xì)胞標(biāo)記和熒光素酶的特性 |
| 關(guān)于儀器的特性等問(wèn)題 |
| 關(guān)于生物發(fā)光與熒光及其它技術(shù)的比較 |
| 關(guān)于技術(shù)應(yīng)用 |
關(guān)于細(xì)胞標(biāo)記和熒光素酶的特性
1. 熒光素酶的發(fā)光是否需要激發(fā)光？ 熒光素酶的發(fā)光是生物發(fā)光，不需要激發(fā)光，但需要底物熒光素(Luciferin)。
2. 熒光素酶的發(fā)光特性如何？ 熒光素腹腔注射老鼠后約一分鐘后表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞開(kāi)始發(fā)光，十分鐘后強(qiáng)度達(dá)到穩(wěn)定的最高點(diǎn)。在最高點(diǎn)持續(xù)約20-30 分鐘后開(kāi)始衰減，約三小時(shí)后熒光素排除，發(fā)光全部消失。最好的檢測(cè)時(shí)間是在注射后15到35分鐘之間
3. 底物熒光素(Luciferin)是如何進(jìn)入小鼠體內(nèi)的？需要多少？ 熒光素是腹腔注射或尾部靜脈注射進(jìn)入小鼠體內(nèi)的，約一分鐘就可以擴(kuò)散到小鼠全身。 大部分發(fā)表的文章中，熒光素的濃度是150mg/kg (見(jiàn)下圖)。20克的小鼠需要3毫克的熒光素，價(jià)錢(qián)約兩到三美元。常用方法是腹腔注射，擴(kuò)散較慢，開(kāi)始發(fā)光慢，持續(xù)發(fā)光長(zhǎng)。若進(jìn)行熒光素靜脈注射，擴(kuò)散快，開(kāi)始發(fā)光快，但發(fā)光持續(xù)時(shí)間很短。
4. 熒光素的體內(nèi)代謝過(guò)程 不同品牌的熒光素底物的代謝過(guò)程不太一樣， 使用前最好做一些體外試驗(yàn)，做一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。下面是我們?cè)囼?yàn)的一些例子：
5. 兩次觀察間隔時(shí)間最短為多長(zhǎng)時(shí)間？ 觀察時(shí)間的間隔沒(méi)有最短限制， 只要觀察的條件控制一致就可以。雖然底物在動(dòng)物體內(nèi)有一定的代謝過(guò)程，但是上一次底物的殘留曲線可以知道（見(jiàn)上圖），可以控制對(duì)下一次觀察結(jié)果的影響。
6. 熒光素酶基因，熒光素酶，熒光素底物有多大？可以透過(guò)血腦屏障嗎？ 熒光素酶有554個(gè)氨基酸，約50KD。熒光素酶的底物熒光素，約280道爾頓。熒光素的水溶性和脂溶性都非常好, 很容易穿透細(xì)胞膜和血腦屏障。
7. 做體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的luciferin 與體外實(shí)驗(yàn)的是不是一樣，如何購(gòu)買(mǎi)？最小包裝多大？ 體內(nèi)生物發(fā)光是用的是D-Luciferin，我們提供1g或小到100mg 的包裝。
8. 如何保證熒光素酶(Luciferase)的穩(wěn)定性？ 熒光素酶基因是插到細(xì)胞染色體內(nèi)的，當(dāng)細(xì)胞分裂、轉(zhuǎn)移、分化時(shí), 熒光酶也會(huì)得到持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)。熒光素酶的半衰期約三個(gè)小時(shí), 所以只有活細(xì)胞才能夠持續(xù)表達(dá)熒光素酶。
9. 標(biāo)記的腫瘤接種以后，會(huì)發(fā)生luciferase的丟失嗎？ 沒(méi)有正式的報(bào)道丟失Luciferase的情況。丟失的可能性及量非常小，不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。一些實(shí)驗(yàn)報(bào)道的結(jié)果中，標(biāo)記的細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)存活幾年的時(shí)間還可以持續(xù)發(fā)光，說(shuō)明Luciferase基因的標(biāo)記非常穩(wěn)定。
10. 在in vitro 的細(xì)胞培養(yǎng)中，為什么要經(jīng)常用抗生素篩選？ 熒光素酶基因標(biāo)記的細(xì)胞株是經(jīng)過(guò)單克隆篩選培養(yǎng)過(guò)的穩(wěn)定的細(xì)胞株。體外培養(yǎng)過(guò)程中，不篩選也可以，只要時(shí)間不是很長(zhǎng)， 接種代數(shù)不要很多。到目前為止，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)基因丟失的情況。但若接種的代數(shù)過(guò)多，建議用藥物篩選一段時(shí)間或從原始的細(xì)胞株培養(yǎng)以保證細(xì)胞發(fā)光的強(qiáng)度。
11. 可以用腫瘤塊而不是細(xì)胞接種嗎？ 可以先用標(biāo)記的細(xì)胞在皮下接種，然后從皮下取出腫瘤塊進(jìn)行原位接種。
12. 熒光素酶基因在標(biāo)記的細(xì)胞中有多少個(gè)COPY，在什么位點(diǎn)？ 細(xì)胞中的copy數(shù)目，和標(biāo)記的位點(diǎn)對(duì)于實(shí)驗(yàn)沒(méi)有任何影響，后來(lái)的實(shí)驗(yàn)中基本不進(jìn)行那樣的研究。
13. 標(biāo)記細(xì)胞與標(biāo)記基因所用的啟動(dòng)子有何不同？ 標(biāo)記細(xì)胞一般用在細(xì)胞內(nèi)能穩(wěn)定表達(dá)的啟動(dòng)子, 顯示細(xì)胞的數(shù)目。標(biāo)記基因一般用此基因的啟動(dòng)子，與此基因平行表達(dá), 顯示此基因的表達(dá)數(shù)目。
14. 熒光素酶的表達(dá)高低與所用啟動(dòng)子的活性有關(guān)嗎？ 有關(guān)，啟動(dòng)子的活性高，則熒光素酶的表達(dá)高，啟動(dòng)子的活性低，則熒光素酶的表達(dá)低。還可以根據(jù)此原理，用特定的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)熒光素酶，來(lái)觀察該啟動(dòng)子在活體動(dòng)物體內(nèi)的特定條件下的表達(dá)情況，并檢測(cè)影響該啟動(dòng)子表達(dá)的因素。這正體現(xiàn)了應(yīng)用活體成像技術(shù)研究的優(yōu)勢(shì)。
15. 有幾種常用的熒光素酶？特性如何？ 常用的有兩種熒光素酶，Luciferase 和 Renilla熒光素酶，二者的底物不一樣，前者的底物是D-luciferin，后者的底物是coelentarizine 。二者的發(fā)光顏色不一樣，前者所發(fā)的光波長(zhǎng)在540-600nm，后者所發(fā)的光波長(zhǎng)在460-540nm左右。前者所發(fā)的光更容易透過(guò)組織，后者在體內(nèi)的代謝比前者快。大部分的發(fā)表文章通常使用前者用作報(bào)告基因， 也有一些文章使用兩者進(jìn)行雙標(biāo)記。
16. 組織切片可以觀察到生物發(fā)光嗎？ 可以，但熒光酶的體外活性保持時(shí)間比較短， 約幾十分鐘。有相關(guān)的文獻(xiàn)。
17. 標(biāo)記好的細(xì)胞的熒光素酶是隨機(jī)還是插入固定的位點(diǎn)？ 插入的位點(diǎn)是隨機(jī)的，但每一個(gè)構(gòu)建好的細(xì)胞株我們都做過(guò)詳細(xì)的分析，與其母細(xì)胞株進(jìn)行詳細(xì)的比較，證明熒光素酶的插入對(duì)細(xì)胞的各種特性(包括生長(zhǎng)周期, 成瘤性等)沒(méi)有造成影響。
18. 能標(biāo)記病毒嗎？能標(biāo)記病毒的某一個(gè)基因嗎？ 可以標(biāo)記病毒，由于病毒在核酸結(jié)構(gòu)上的特性，每個(gè)病毒標(biāo)記的方法不一樣，具體的可以參見(jiàn)有關(guān)文獻(xiàn)。還沒(méi)有看到標(biāo)記病毒某一個(gè)基因的報(bào)道， 但理論上講，將熒光素酶基因與想標(biāo)記的基因平行表達(dá)，可以標(biāo)記任何基因。
19. 細(xì)菌標(biāo)記問(wèn)題 對(duì)于細(xì)菌標(biāo)記，一般利用發(fā)光酶基因操縱子luxABCDE控制的編碼熒光素酶的基因和編碼熒光素酶底物合成酶的基因組成。 利用這種辦法進(jìn)行標(biāo)記的細(xì)菌會(huì)持續(xù)發(fā)光，不需要外源性底物。但是一般細(xì)菌標(biāo)記需要轉(zhuǎn)座子的幫助把外源基因插入到細(xì)菌染色體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。已經(jīng)標(biāo)記好了幾十種革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，在這方面很有經(jīng)驗(yàn)。具體標(biāo)記情況請(qǐng)與我們直接聯(lián)系。
關(guān)于儀器的特性等問(wèn)題
20. 為何活體成像技術(shù)能看到體內(nèi)發(fā)出的可見(jiàn)光？ 兩個(gè)主要原因使可見(jiàn)光成像技術(shù)能夠看到體內(nèi)發(fā)出的微弱的可見(jiàn)光。一是高靈敏度的制冷CCD鏡頭，可達(dá)到零下-105°C，使體內(nèi)發(fā)出的非常少的光子也能夠檢測(cè)到。 二是絕對(duì)密封的暗箱裝置，可以屏蔽包括宇宙射線在內(nèi)的所有光線。
21. 正常成體小鼠可以看到體內(nèi)發(fā)光嗎？ 是否不需要裸鼠？ 可以。成體老鼠和裸鼠，幼鼠及胚胎的區(qū)別只在與對(duì)可見(jiàn)光的穿透性不同，我們的技術(shù)可以看到成體正常老鼠的體內(nèi)發(fā)光。這正是這項(xiàng)技術(shù)的價(jià)值所在。可見(jiàn)光的穿透能力在3-4cm，所以大鼠也可以作為活體成像的動(dòng)物， 并有很多關(guān)于大鼠的文章。
22. 能檢測(cè)在組織內(nèi)部的發(fā)光嗎？光能透過(guò)肌膚多深？ 可以。若有發(fā)光足夠強(qiáng)的標(biāo)記細(xì)胞，在老鼠體內(nèi)任何一個(gè)地方都能看到約一立方毫米的細(xì)胞瘤(約106細(xì)胞)。穿透性可達(dá)到3-4CM (小鼠身體厚度約7-8 CM)。
23. 儀器靈敏度如何？ 儀器對(duì)發(fā)光細(xì)胞檢測(cè)的靈敏度與細(xì)胞發(fā)光的強(qiáng)度有關(guān)。在標(biāo)記細(xì)胞活躍發(fā)光的情況下， 儀器可以檢測(cè)到最少100個(gè)皮下接種的發(fā)光細(xì)胞。若細(xì)胞在體內(nèi)位置深(如原位種植)，比如內(nèi)臟，最少能檢測(cè)到的細(xì)胞數(shù)目需要多一些。一般每增加0.5cm可檢測(cè)到的最少細(xì)胞數(shù)增加一個(gè)數(shù)量級(jí)。具體評(píng)論見(jiàn)BLOOD 2003 年的一篇文章： “the sensitivity of cell detection in vivo is surprisingly high and exceeds even the sensitivity of detection by flow cytometry ex vivo. As few as 7x103 cells are detectable in the lungs early after injection, 2-2.5x104 cells within liver or spleen, and as few as 1x104 tumor cells within the BM of a femur give rise to a sufficient signal to be detected externally. In other experiments using cells with even higher luciferase expression, as few as 100 cells can be reliably detected in the peritoneal cavity of living animals. BLOOD, 2003, V.101, pp640-8
24. 能檢測(cè)分散在各處的單個(gè)細(xì)胞嗎? 可以檢測(cè)到流體的細(xì)胞，只要細(xì)胞總數(shù)達(dá)到100以上。許多文章，其中用熒光素酶標(biāo)記了T細(xì)胞, NK細(xì)胞, 造血干細(xì)胞和其他淋巴細(xì)胞。在這些標(biāo)記的細(xì)胞總數(shù)達(dá)到一百以上時(shí)，我們的儀器可以觀察到信號(hào)（見(jiàn)上篇關(guān)于T細(xì)胞的索引）。
25. 活體成像技術(shù)如何定量分析？ 活體可見(jiàn)光成像技術(shù)采取絕對(duì)光子數(shù)的計(jì)算方法，記錄單位時(shí)間內(nèi)、單位面積、單位角度接受到的光子數(shù)。這樣，不同時(shí)間、不同儀器的測(cè)量結(jié)果可以進(jìn)行比較，具有絕對(duì)的定量意義。每一個(gè)新標(biāo)記的細(xì)胞株都要進(jìn)行全面的定量分析才能用于定量實(shí)驗(yàn)，其中包括在體外和體內(nèi)固定位置細(xì)胞發(fā)光的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
26. 不同的組織對(duì)光的吸收程度不一樣，不同的組織之間能進(jìn)行定量研究嗎？ 不能。目前的文獻(xiàn)都是同樣的組織比較，進(jìn)行同樣組織的前后不同時(shí)間的定量分析。
27. 熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度是否同細(xì)胞的數(shù)量成正比？ 是的，熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度同標(biāo)記的靶點(diǎn), 包括細(xì)胞、基因、細(xì)菌和病毒的數(shù)量成正比。密西根大學(xué)Brian Ross發(fā)表的一篇文章專門(mén)研究了這個(gè)問(wèn)題。確定熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)成正比關(guān)系，并且線性關(guān)系到0.9 以上。
28. 儀器的解析度如何？分辨率如何？ 儀器的最高解析度在0.1毫米左右。由于可見(jiàn)光是漫射光，在體內(nèi)走的路線不是直線，所以該儀器的體內(nèi)光源的分辨率不是很好，通過(guò)該儀器觀察的發(fā)光圖片不能代表發(fā)光物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，在動(dòng)物體表所捕捉的發(fā)光信號(hào)只能代表發(fā)光的強(qiáng)度和大概的位置。小動(dòng)物CT和MRI，在這方面具有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)榉派渚�走的路線很直。
29. 能定位在哪個(gè)臟器嗎？憑什么？當(dāng)進(jìn)行腫瘤轉(zhuǎn)移研究的實(shí)驗(yàn)時(shí)，在觀察期間，不殺死動(dòng)物，如何判斷某一部位發(fā)光是由于皮膚、皮下組織，肌肉，臟器還是骨骼的腫瘤轉(zhuǎn)移造成的發(fā)光？特別是對(duì)于一些較小的臟器，如淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。 此技術(shù)無(wú)法直接定位標(biāo)記細(xì)胞和基因所在的組織和器官。但是實(shí)驗(yàn)人員憑經(jīng)驗(yàn)，可以靠發(fā)光細(xì)胞在老鼠的身體位置推斷標(biāo)記細(xì)胞或基因所在的臟器。若需要證實(shí), 還需要將老鼠解剖，進(jìn)行體外檢測(cè)。
30. 拍攝普通照片的和生物發(fā)光照片的是一個(gè)CCD鏡頭嗎? 是, 只不過(guò)爆光時(shí)間和快門(mén)不一樣。
31. 鏡頭那么低溫度，動(dòng)物不會(huì)凍死嗎？ 低溫只是在CCD鏡頭的小環(huán)境內(nèi)。其它范圍內(nèi)都是室溫。
32. 使用麻醉機(jī)相對(duì)于腹腔注射麻醉有什么優(yōu)點(diǎn)？ 麻醉系統(tǒng)可以對(duì)小鼠的麻醉情況包括時(shí)間，程度等有更精確的控制。使用起來(lái)也會(huì)更加方便。
33. 熒光配件相對(duì)于其他公司的熒光的優(yōu)勢(shì)在哪里？ 相對(duì)寬的應(yīng)用范圍，可以觀察波長(zhǎng)在400-900nm的熒光，因此適用于GFP及各種熒光染料的標(biāo)記。還有一套12張專門(mén)的濾光片用來(lái)消除非特異性的背景光。并且其成像速度快，適合大批量的實(shí)驗(yàn)。
關(guān)于生物發(fā)光與熒光及其它技術(shù)的比較
34. 熒光檢測(cè)與生物發(fā)光檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)與劣勢(shì)比較如何？ 熒光發(fā)光需要激發(fā)光，但生物體內(nèi)很多物質(zhì)在受到激發(fā)光激發(fā)后，也會(huì)發(fā)出熒光，產(chǎn)生的非特異性熒光會(huì)影響到檢測(cè)靈敏度。特別是當(dāng)發(fā)光細(xì)胞深藏于組織內(nèi)部，則需要較高能量的激發(fā)光源，也就會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的背景噪音。作為體內(nèi)報(bào)告源，生物發(fā)光較之熒光的優(yōu)點(diǎn)之一為不需要激發(fā)光的激發(fā), 它是以酶和底物的特異作用而發(fā)光, 且動(dòng)物體自身不會(huì)發(fā)光，這樣生物發(fā)光就具有極低的背景。雖然熒光信號(hào)遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于生物發(fā)光，但極低的自發(fā)光水平使得生物發(fā)光的信噪比遠(yuǎn)高于熒光。另外，生物發(fā)光信號(hào)可以用于精確定量。因?yàn)闊晒饷富蚴遣迦爰?xì)胞染色體中穩(wěn)定表達(dá)的，單位細(xì)胞的發(fā)光數(shù)量很穩(wěn)定。 即便標(biāo)記細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)有復(fù)雜的定位，亦可從動(dòng)物體表的信號(hào)水平直接得出發(fā)光細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量。而對(duì)于熒光，光在體內(nèi)路徑較長(zhǎng)。信號(hào)水平取決于激發(fā)光的強(qiáng)度、發(fā)光細(xì)胞的數(shù)量、靶點(diǎn)的深度，光線穿過(guò)的組織對(duì)其的吸收及散射等因素，使得熒光強(qiáng)度很難定量。 因?yàn)檫@些原因，目前大部分高水平的文章還是應(yīng)用生物發(fā)光的方法來(lái)研究活體動(dòng)物體內(nèi)成像。 但是，熒光成像有其方便，便宜，直觀，標(biāo)記靶點(diǎn)多樣和易于被大多數(shù)研究人員接受的優(yōu)點(diǎn)，在一些植物分子生物學(xué)研究和簡(jiǎn)單的動(dòng)物體內(nèi)研究方面也得到應(yīng)用。對(duì)于不同的研究，可根據(jù)兩者的特點(diǎn)（表1）以及實(shí)驗(yàn)要求，選擇合適的方法。
表1 生物發(fā)光及熒光特點(diǎn)的比較
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優(yōu) 點(diǎn) |
缺 點(diǎn) |
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生物發(fā)光 |
高靈敏度
對(duì)環(huán)境變化反應(yīng)迅速
成像速度快，圖像清楚
在體內(nèi)可檢測(cè)到102細(xì)胞 |
信號(hào)較弱, 需要靈敏的CCD鏡頭
需要注入熒光素
儀器精密度要求高
細(xì)胞或基因需要標(biāo)記 |
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熒光 |
多種蛋白及染料可用于
多重標(biāo)記，標(biāo)記相對(duì)簡(jiǎn)單
可同時(shí)用于FACS分類
未來(lái)可能用于人體 |
非特異性熒光限制了靈敏度
體內(nèi)檢測(cè)最低約106細(xì)胞
需要不同波長(zhǎng)的激發(fā)光
很難精確體內(nèi)定量 |
35. 為什么用熒光素酶, 而不是用綠色熒光蛋白來(lái)檢測(cè)體內(nèi)發(fā)光? 一方面是熒光素酶的偏紅光比綠色熒光蛋白的綠光在體內(nèi)的穿透性要強(qiáng)近一百倍。另一方面, 熒光 素酶是靠酶和底物的相互反應(yīng)發(fā)光，特異性很強(qiáng)。這樣一來(lái)，得到的信噪比很高。而熒光蛋白需要激發(fā)光來(lái)產(chǎn)生反射光。老鼠的毛皮、肌膚以及一些食物都會(huì)產(chǎn)生非特異性熒光，造成很強(qiáng)的非特異性背景光，得到的信噪比很小。雖然熒光蛋白的發(fā)光強(qiáng)度很高，大量應(yīng)用于體外檢測(cè)；但熒光酶標(biāo)記的方法更適合于體內(nèi)檢測(cè)。熒光酶體內(nèi)檢測(cè)的靈敏度要比熒光蛋白在體內(nèi)的靈敏度至少高三個(gè)數(shù)量級(jí)(1000倍)。
36. 發(fā)光的波長(zhǎng)與體內(nèi)的穿透性如何關(guān)系？ 熒光素酶發(fā)出的光主要是偏紅光，與綠色熒光蛋白(GFP)的綠色熒光不同。熒光素酶的偏紅光比綠色熒光蛋白的綠光在體內(nèi)的穿透性要強(qiáng)近一百倍。因?yàn)楣庠诓溉閯?dòng)物組織內(nèi)傳播時(shí)會(huì)被散射和吸收，不同類型的細(xì)胞和組織吸收光子的特性并不一樣。血紅蛋白（hemoglobin）是造成體內(nèi)可見(jiàn)光被吸收的主要因素，其吸收可見(jiàn)光中藍(lán)綠光波段的大部分。但是在可見(jiàn)光大于600納米的紅光波段，血紅蛋白的吸收作用卻很小。因此，在偏紅光區(qū)域, 大量的光可以穿過(guò)組織和皮膚而被檢測(cè)到。
37. 相對(duì)于傳統(tǒng)技術(shù)，生物發(fā)光成像技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在哪些研究領(lǐng)域？ 該技術(shù)是一項(xiàng)在某些領(lǐng)域有很大不可替代優(yōu)勢(shì)的技術(shù)，但是并不是萬(wàn)能的技術(shù)。與傳統(tǒng)技術(shù)相比，腫瘤轉(zhuǎn)移研究，基因治療，流行病學(xué)的發(fā)病學(xué)研究，干細(xì)胞示蹤，白血病的相關(guān)研究等是該技術(shù)非常有優(yōu)勢(shì)的領(lǐng)域。在藥物開(kāi)發(fā)方面，用該技術(shù)進(jìn)行腫瘤的藥效研究，比傳統(tǒng)方法更靈敏，還可以通過(guò)一系列轉(zhuǎn)基因疾病動(dòng)物模型，來(lái)快速直觀的進(jìn)行相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理和藥物篩選研究。
38. 生物發(fā)光成像不能標(biāo)記的領(lǐng)域？ 小分子藥物，多肽等。這些方法現(xiàn)今為止的最好的標(biāo)記方法還是以放射性標(biāo)記。
39. 生物發(fā)光成像和小動(dòng)物CT比較有什么特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)？ 小動(dòng)物CT的基本原理是利用X射線成像，通過(guò)對(duì)所觀察對(duì)象的密度變化，進(jìn)行動(dòng)物內(nèi)部結(jié)構(gòu)方面的研究。他的優(yōu)點(diǎn)是分辨率高，不需標(biāo)記。缺點(diǎn)是特異性差， 在腫瘤很小時(shí)無(wú)法區(qū)分腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，并且對(duì)于腫瘤細(xì)胞的活躍程度不敏感。如2005年1月JCI的一篇關(guān)于乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的文章里，詳細(xì)比較了小動(dòng)物CT與生物發(fā)光成像在腫瘤轉(zhuǎn)移方面的靈敏度。小動(dòng)物CT要在接種16天以后，成瘤很明顯后才能夠觀察到骨轉(zhuǎn)移的存在。而生物發(fā)光成像在接種后當(dāng)天就可以實(shí)時(shí)觀察到癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和走向。并且，小動(dòng)物CT需要對(duì)動(dòng)物有較強(qiáng)的X-射線照射， 容易引起突變，對(duì)動(dòng)物的生理有一定影響。
40. 小分子藥物的標(biāo)記用熒光與PET，哪一個(gè)更好？ 如果用熒光蛋白，可以標(biāo)記細(xì)胞或病毒。 如果使用合適的熒光小分子， 如Cyt5.5等，可以標(biāo)記蛋白例如抗體等大分子或者多肽。但是再小的分子如小分子藥物等，只能用放射性同位素標(biāo)記， 用PET或SPECT的方法進(jìn)行研究。 因?yàn)榧词篃晒饣鶊F(tuán)如Cyt5.5也會(huì)影響小分子藥物的藥理藥效和代謝活動(dòng)。
41. 體內(nèi)可見(jiàn)光技術(shù)和其它體內(nèi)成像技術(shù)(PET, CT, 及MRI)的比較 簡(jiǎn)單優(yōu)點(diǎn)：適用于小動(dòng)物的研究，靈敏度高，特異性好，操作簡(jiǎn)單，無(wú)放射性，價(jià)錢(qián)便宜。缺點(diǎn)：無(wú)法標(biāo)記小分子藥物，暫不適用于人類和臨床(正在研究中)，分辨率低，體內(nèi)精確定位有限。
關(guān)于技術(shù)應(yīng)用
42. 可以用熒光素酶基因標(biāo)記干細(xì)胞嗎？如何標(biāo)記？ 可以，標(biāo)記干細(xì)胞有幾種方法。一種是標(biāo)記組成性表達(dá)的基因，做成轉(zhuǎn)基因小鼠，干細(xì)胞就被標(biāo)記了，從此小鼠的骨髓取出造血干細(xì)胞，移植到另外一只小鼠的骨髓內(nèi)，可以用該技術(shù)示蹤造血干細(xì)胞在體內(nèi)的增殖和分化及遷徙到全身的過(guò)程。另外一種方法是用慢病毒標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞。以上內(nèi)容都有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。
43. 該技術(shù)在抗腫瘤新藥研究方面的應(yīng)用如何？ 在用該技術(shù)進(jìn)行抗腫瘤新藥的研究方面，主要是藥效學(xué)評(píng)價(jià)。用活體成像的方法比傳統(tǒng)技術(shù)有更高的靈敏度，當(dāng)用傳統(tǒng)的方法，還不能檢測(cè)到瘤塊時(shí)，用該技術(shù)已經(jīng)可以檢測(cè)到很強(qiáng)的信號(hào)。還有由于該技術(shù)只是檢測(cè)活躍的細(xì)胞，那些已經(jīng)凋亡的癌細(xì)胞是檢測(cè)不到的，而用傳統(tǒng)的方法，不能區(qū)別正常的癌細(xì)胞與凋亡的癌細(xì)胞，所以該技術(shù)可以比傳統(tǒng)技術(shù)更早的發(fā)現(xiàn)藥物的療效，比傳統(tǒng)方法更靈敏。目前已經(jīng)應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行的抗腫瘤藥效研究的有SU11248（乳腺癌新藥），Topotecan（已經(jīng)上市的抗腫瘤） 等。
44. 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的關(guān)系，如何研究？ PNAS(美國(guó)科學(xué)院院報(bào))上發(fā)表的一篇文章介紹，可利用體內(nèi)可見(jiàn)光成像技術(shù)研究活體動(dòng)物體內(nèi)蛋白與蛋白的相互作用。具體方法是：將分開(kāi)時(shí)都不單獨(dú)發(fā)光的熒光酶的C端和N端分別連接在兩個(gè)不同的蛋白質(zhì)上，若是這兩個(gè)蛋白質(zhì)之間有相互作用,，熒光酶的C端和N端就會(huì)被帶到一起, 產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象.。詳細(xì)內(nèi)容見(jiàn)文章。
45. 可以研究藥物對(duì)蛋白質(zhì)相互作用嗎？ 可以。在活體條件下應(yīng)用該技術(shù)研究藥物對(duì)蛋白質(zhì)相互作用的影響。可以把在體外實(shí)驗(yàn)中無(wú)法模擬的活體環(huán)境對(duì)蛋白質(zhì)相互作用的影響也計(jì)算在內(nèi)（PNAS04）。
46. 可以研究蛋白質(zhì)核運(yùn)輸嗎？ 可以。研究方法類似于研究蛋白質(zhì)相互作用的方法。在熒光素酶基因的一端接要研究的蛋白質(zhì)的基因，另一端接肯定在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)的蛋白的基因，當(dāng)核外的蛋白運(yùn)輸?shù)胶藘?nèi)時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致熒光素酶N斷、C端靠近，恢復(fù)發(fā)光。
47. 可以用該技術(shù)研究基因表達(dá)嗎？ 可以，研究基因表達(dá)可以從影響基因表達(dá)的各個(gè)不同的層面進(jìn)行相關(guān)的研究，如利用融合蛋白（p27-luc融合蛋白研究其在Cdk細(xì)胞分裂周期的表達(dá)Nature Medicine 2004）, 興趣基因啟動(dòng)子控制的熒光素酶（Catenin在腫瘤轉(zhuǎn)移的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制Nature 2005）, iRNA方式（HCV-luc的iRNA抑制表達(dá)Nature 2002）, 和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（NFkB在Hypoxia的表達(dá)JCI 2004）等方法。若有興趣，可以與我們索取相關(guān)文章。
48. 細(xì)胞凋亡的研究 PNAS(美國(guó)科學(xué)院院報(bào))上發(fā)表的一篇文章介紹，可利用體內(nèi)可見(jiàn)光成像技術(shù)直接觀察活體動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞凋亡(附上細(xì)胞凋亡的文章)。具體方法是：用分子生物學(xué)方法在熒光酶的兩端連接上抑制其發(fā)光的蛋白(如雌激素)，但在其連接處加上CASPASE(細(xì)胞凋亡時(shí)特異表達(dá)的一種酶)的酶切點(diǎn)。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，表達(dá)CASPASE，切開(kāi)抑制熒光酶發(fā)光的蛋白，使熒光酶開(kāi)始發(fā)光。詳細(xì)內(nèi)容見(jiàn)文章。
49. 該技術(shù)只是能示蹤細(xì)胞的走向，而不能進(jìn)行相關(guān)的機(jī)理研究？ 不對(duì)。該技術(shù)最初的應(yīng)用是在觀察腫瘤細(xì)胞、病原微生物或干細(xì)胞的走向，分布等，但是目前隨著該技術(shù)的普及，其應(yīng)用已經(jīng)擴(kuò)展到很多方面，原來(lái)只能在分子水平上研究的內(nèi)容，現(xiàn)在也可以在整體動(dòng)物水平上進(jìn)行更接近活體環(huán)境狀態(tài)的研究，如蛋白質(zhì)相互作用，細(xì)胞凋亡，基因表達(dá)等等。 基本上把分子生物學(xué)在體外的一些研究方法在體內(nèi)進(jìn)行實(shí)現(xiàn)。由于體內(nèi)與體外的各種微環(huán)境上的差異，造成體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)活體生物機(jī)理研究的局限性，相信在整體水平的研究，必將有廣闊的發(fā)展空間。
50. 在藥物臨床前研究中的應(yīng)用如何？ 利用活體成像技術(shù)高靈敏度，觀察方便的特點(diǎn)，在抗腫瘤藥物臨床前研究中，通過(guò)給予腫瘤接種的小鼠不同的劑量，并不同的給藥時(shí)間、不同的給藥途徑，觀察抗腫瘤藥物的最佳給藥途徑、給藥劑量并給藥時(shí)間，從而制定合適的劑型與服藥時(shí)間。我們搜集了許多藥物研究方面的相關(guān)文獻(xiàn)，請(qǐng)同我們聯(lián)系， 希望與您共享。
51. 相對(duì)于傳統(tǒng)技術(shù)，在腫瘤學(xué)研究中的優(yōu)勢(shì)在哪里？ 有更高的靈敏度，可以定量研究，可以方便的觀察腫瘤轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的情況，可以避免由于宰殺老鼠而造成的組間差異，可以節(jié)省動(dòng)物的成本。 并且應(yīng)為這項(xiàng)技術(shù)的超靈敏性，微小的腫瘤轉(zhuǎn)移兆（少到100多個(gè)細(xì)胞）就可以檢測(cè)到。 比用傳統(tǒng)方法可以檢測(cè)到的靈敏度大大提高。也可應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)制作自發(fā)腫瘤模型從事相關(guān)的研究。
52. 如何利用該技術(shù)研究藥物代謝？ 標(biāo)記與藥物代謝有關(guān)的基因，比如CYP3A4等，研究不同的藥物對(duì)該基因表達(dá)的影響，從而可以間接知道相關(guān)藥物在體內(nèi)代謝的情況。并且，小分子及多肽藥物也可以利用熒光素（如Cyt 5.5等）標(biāo)記， 觀察它們?cè)趧?dòng)物體內(nèi)的走向，變化及代謝等。
53. 如何進(jìn)行相關(guān)疾病機(jī)理的研究？ 可以標(biāo)記與某種疾病密切相關(guān)的基因，做成轉(zhuǎn)基因小鼠，通過(guò)特定的藥物作用或其他條件下，該基因表達(dá)的變化，來(lái)推測(cè)該疾病的發(fā)病機(jī)理，藥物對(duì)該疾病治療的效果等。我們已經(jīng)標(biāo)記好了幾十種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物提供給研究人員，也提供相關(guān)方面的服務(wù)。
54. 在中醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用前景如何？ 由于該技術(shù)在整體動(dòng)物水平上觀察生物學(xué)變化，與中醫(yī)的整體觀念有些相似。目前，有很多中藥在治療疾病上有很好的療效，但是由于其復(fù)雜的組分，復(fù)雜的作用機(jī)理，很難用目前的分子水平的研究解釋清楚。如果從宏觀的水平，根據(jù)所研究?jī)?nèi)容的不同，應(yīng)用該技術(shù)的一些疾病模型，從基因表達(dá)等方面觀察某些中藥的治療效果，將是一個(gè)不錯(cuò)的方向。臺(tái)灣的中醫(yī)學(xué)界在這個(gè)方面有很深的研究。
55. 在免疫學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用如何？ 觀察流體細(xì)胞在體內(nèi)的動(dòng)向和變化使這個(gè)技術(shù)的一大優(yōu)勢(shì)。 可以標(biāo)記免疫細(xì)胞，如T 細(xì)胞，NK細(xì)胞，觀察免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺死。也可以標(biāo)記干細(xì)胞及異體細(xì)胞，觀察干細(xì)胞煙花和器官移植的研究。也有一些關(guān)于免疫因子的研究報(bào)道等。
56. 在RNA阻斷方面的應(yīng)用如何？可以標(biāo)記siRNA嗎？ 可以用熒光素酶基因標(biāo)記興趣基因，利用熒光素酶的iRNA觀察其對(duì)興趣基因的表達(dá)抑制（Nature 2002）. 也可以標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，間接觀察阻斷RNA對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷。
57. 相對(duì)傳統(tǒng)技術(shù)，在抗生素藥物篩選方面的優(yōu)勢(shì)如何？ 同一批老鼠持續(xù)觀察，避免個(gè)體間差異； 有更高的靈敏度，可以在感染早期就進(jìn)行活體觀察。可以有結(jié)構(gòu)信息，在活體動(dòng)物整體上觀察感染途徑。定量，可以比較各個(gè)器官的感染程度，更直觀。
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不適合。由于熒光標(biāo)記檢測(cè)的靈敏度，以及熒光檢測(cè)的深度等限制，活體光學(xué)成像不是很適合進(jìn)行小分析藥物活體示蹤的實(shí)驗(yàn)。核素標(biāo)記的PET和SPECT技術(shù)由于檢測(cè)的深度、靈敏度以及標(biāo)記的原因是適合進(jìn)行小分析藥物活體示蹤實(shí)驗(yàn)的技術(shù)，該領(lǐng)域是一個(gè)正在蓬勃發(fā)展的領(lǐng)域，但是由于GE、西門(mén)子等公司的相關(guān)產(chǎn)品價(jià)格昂貴，很難滿足大多數(shù)科研工作者的需要，所以一時(shí)間該技術(shù)沒(méi)有得到普及和應(yīng)用。但是國(guó)外有一些公司正在開(kāi)發(fā)價(jià)格適中的產(chǎn)品，不久就會(huì)進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng)，將使中國(guó)的科研工作者應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行小分子藥物的吸收、分布、代謝、分泌等研究變的方便起來(lái)。該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)三維成像，詳細(xì)了解標(biāo)記物的位置。應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行骨骼代謝的例子見(jiàn)右圖：
