1)1mL凍存細胞懸液裝于1.8ml的凍存管中,置于裝滿干冰的泡沫保溫盒中進行運輸;收到細胞后請盡快解凍復蘇細胞進行培養,如無法立刻進行復蘇操作,凍存細胞可在-80℃的條件下保存1個月。
2)T-25培養瓶充滿完全培養基后進行常溫運輸;收到細胞后請鏡下觀察細胞生長狀態,如鋪瓶率超過85%請立即進行傳代操作,如懸浮的細胞較多,請將培養瓶至于培養箱中靜置過夜以幫助未死亡的懸浮細胞能夠再次貼壁。
2) 添加0.25%胰蛋白酶消化液1mL至培養瓶中,輕微轉動培養瓶至消化液覆蓋整個培養瓶底后,吸出多余胰蛋白酶消化液,37℃溫浴1-3min;倒置顯微鏡下觀察,待細胞回縮變圓后,再加入5ml完全培養基終止消化;
4) 待細胞完全貼壁后,培養觀察;之后每隔2-3天更換新鮮的完全培養基。
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大鼠骨骼肌衛星細胞多少錢公原代細胞分離:
一、細胞培養
1取材 在無菌環境下從機體取出某種組織細胞(視實驗目的而定),經過一定的處理(如消化分散細胞、分離等)后接入培養器血中,這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的首次培養稱為原代培養。2培養 將取得的組織細胞接入培養瓶或培養板中的過程稱為培養。3凍存及復蘇(可參閱后面有關章節)為了保存細胞,特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株,要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度-196℃,將細胞收集至凍存管中加入含保護劑(一般為二甲亞砜或甘油)的培養基,以一定的冷卻速度凍存,最終保存于液氮中。在極低的溫度下,細胞保存的時間幾乎是無限的。復蘇一般采用快融方法,即從液氮中取出凍存管后,立即放入37℃水中,使之在一分鐘內迅速融解。然后將細胞轉入培養器皿中進行培養。
二、原代細胞分離
凡是來源于胚胎、組織器官及外周血,經特殊分離方法制備而來的原初培養的細胞稱之為原代細胞。1懸浮細胞的分離方法組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料,最簡單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘。經離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層,這樣可根據需要收獲目的細胞。2實體組織材料的分離方法對于實體組織材料,由于細胞間結合緊密,為了使組織中的細胞充分分散,形成細胞懸液,可采用機械分散法(物理裂解)和消化分離法。
三、細胞增殖檢測技術
目前主要有兩種用于檢測細胞增殖能力的方法。一種是直接的方法,通過直接測定進行分裂
的細胞數來評價細胞的增殖能力。另一種是間接的方法,即細胞活力(cell viability)檢測方法,通過檢測樣品中健康細胞的數目來評價細胞的增殖能力。顯然,細胞活力檢測法并不能最終證明檢測樣品中的細胞是否在增殖。如細胞在某一培養條件下會自發啟動凋亡程序,但藥物的干擾可抑制凋亡的發生;這時若采用細胞活力檢測法,顯然可以區分兩種條件下的細胞數量,但我們并不能從藥物干擾組細胞數大于對照組的事實說明藥物可促進細胞增殖的結論。所以最直接的證據應該采用方法一。
其中常見檢測:CCK8檢測法 ,MTT檢測法,Brdu檢測法,Edu檢測法,平板克隆形成。
四、細胞周期檢測技術
細胞周期指由細胞分裂結束到下一次細胞分裂結束所經歷的過程,所需的時間叫細胞周期時間。
常用的方法:流式檢測細胞周期,標記有絲分裂百分率法。
五、細胞凋亡檢測
常見檢測方法:流式檢測細胞凋亡,線粒體膜電位,活性氧檢測,Hoechst染色,電鏡,TUNEL。
六、大鼠骨骼肌衛星細胞多少錢公細胞轉移能力檢測
常見檢測方法:細胞劃痕實驗,Transwell實驗,Invasion實驗