傳統的Western Blot，耗時長，手工操作多，重現性差（CV>35%）。遇到珍貴樣本（蛋白量不足）通常會進行strip-reprobe（洗脫-重雜交）的方式進行蛋白質多靶點的分析。

然而，傳統Western Blot進行strip-reprobe（洗脫-重雜交）時會面臨：

1.洗脫次數不夠，無法充分解離靶點和抗體，影響二次雜交。

2.洗脫次數太多，膜上靶點丟失太多，定量更加不準。

3.每個靶點和抗體親和力不同，沒有通用試劑和方法。
 

為了克服這些局限性，

ProteinSimple Jess RePlex技術正式上線！！
 

Jess RePlex檢測技術特點：

• 只需1份3μl樣本(分選干細胞、免疫微環境細胞、珍稀臨床樣本等）

• 2次連續自動檢測：一根毛細管洗脫-重雜交技術

• 結合Jess多通道檢測：化學發光、雙色紅外熒光、總蛋白檢測通道

• 實現珍貴樣品多靶點的定量檢測分析（不同靶蛋白、靶蛋白不同亞型、靶蛋白磷酸化、樣本總蛋白等）
   

Jess RePlex檢測原理：

Jess RePlex應用舉例：

RePlex超高的洗脫效率
 

RePlex中的關鍵步驟是在第一輪探測后能有效去除抗體。因此，評估了針對Jurkat和MCF7裂解物的pan AKT/AKT1/AKT2/p-AKT1/p-AKT2/p-GSK3b抗體的去除效率。結果顯示，所有測試的抗體均顯示出超過96％的去除效率，而大多數測試的抗體均顯示出98％或更高的去除率。這些數據表明進行第二輪抗體探測時，與第一輪探測幾乎沒有交叉。
 

RePlex出色的重雜交信號強度和高重復性

為了證明探針1和探針2之間的信號強度和可重復性沒有受到影響，在兩個檢測步驟中測量了MCF7裂解物中AKT1和AKT2抗體的信號強度。結果顯示，不管檢測每種蛋白質的順序如何，在RePlex分析中在探針1或探針2中檢測到的MCF7裂解物中的AKT1和AKT2在兩個檢測周期中均具有出色的重現性和相似的信號強度。
 

一份樣品不同靶點的檢測
 

RePlex檢測技術可以檢測同一樣品中多種蛋白質磷酸化的狀態變化，并對其進行定量分析（使用對照和經LY294002處理的Jurkat細胞的裂解物的p-AKT/p-GSK3b/p-cRaf的定量分析）。
 

一份樣品相近分子量靶點的檢測
 

利用RePlex技術表征了多種組織類型中AKT的磷酸化狀態。同一毛細管中檢測多種組織類型，包括肝，腎，結腸，腦，乳腺和肺中的panAKT和p-AKT。同時分析了不同組織中歸一化panAKT后，p-AKT信號的變化，即不同組織顯示出不同水平的AKT表達和磷酸化。
 

一份樣品多靶點的檢測

利用RePlex技術可以在第一輪免疫雜交中進行不同靶蛋白的測定，并在同一毛細管中進行第二輪總蛋白檢測。利用未經處理和用人IGF1（hIGF1）處理過的MCF7細胞，第一輪檢測Pan AKT（NIR通道）和p-AKT（化學發光通道），第二輪檢測同一根毛細管中的總蛋白。結果顯示，利用Jess不同通道以及RePlex技術可以達到一份樣品獲取多個靶點的定量數據。
 

結論：

傳統Western Blot若從單個樣本中獲取更多的蛋白信息，即為了節省珍貴或昂貴的樣品，需要進行strip-reprobe（洗脫-重雜交）。然而，眾所周知該技術會遭受不可預測的蛋白質損失，并且通常需要冗長的優化以實現最佳的剝離效率并使蛋白質在印跡上的保留最大化。這使得幾乎不可能使用標準的條帶和探針技術進行任何定量分析。相比之下，Simple Western平臺Jess開發的RePlex技術是一種優化的自動化兩步免疫分析，可以實現多個靶標的高效抗體去除和出色的目標蛋白在樣品毛細管中的保留，從而可以實現在一個樣品中獲得更多的蛋白信息。