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主題：腦刺激技術

• 經(jīng)顱電刺激
• 經(jīng)顱磁刺激
• 感覺刺激
• 深部腦刺激
• 光遺傳刺激

講師：周正

瑞沃德高級產(chǎn)品方案經(jīng)理，專注于神經(jīng)環(huán)路研究，在疼痛及漸凍癥模型制備，腦刺激/光纖記錄/在體電生理實驗上有著豐富的經(jīng)驗，致力于為客戶提供專業(yè)的神經(jīng)信號實驗方案。

主題：腦機接口技術

• 無創(chuàng)式腦機接口
• 半植入式腦機接口
• 全植入式腦機接口

講師：宋思賢

中國科學院大學碩士研究生，專注于腦機接口研究，特別是無創(chuàng)式腦機接口和全植入式腦機接口，研究方向主要為神經(jīng)信號處理和環(huán)路解析。

上期直播間互動問題
這次我們全部為小伙伴解答

1. PCR實驗重復性很差是什么原因呢？
答：這個看是哪類重復性很差。
如果是同個批次內的復孔重復差，第一個主要原因：以加樣操作不準確導致，可以使用排槍或規(guī)范移液槍使用來減少操作誤差，還有需要定期對移液槍進行校準哦；第二個原因：儀器使用年限過長，PCR儀器的每個孔的溫度存在差異，這個需要檢修校準；第三個原因：模板濃度太低，樣品初始濃度越低,，重復性越差，應減少樣品的稀釋倍數(shù)。

如果是不同批次間的重復差，除卻以上原因，還存在試劑上的批次差異，應當減少試劑批次和種類的差異，盡量選擇同一生產(chǎn)商同一批次的產(chǎn)品進行。

2.請問我的標準曲線擴增不出來是怎么回事？
答：這個只能例舉一些情況，需要進行排查。首先可以使用一個明確知道是正常PCR體系（陽性對照）進行測試，這樣排查下是否是PCR試劑儀器等因素，第二，由于是標準曲線，標準樣DNA模板，用NanoDrop或者Qubit核酸蛋白定量儀檢查模板質量和濃度。

3.出現(xiàn)片狀拖帶該怎么解決呢？
答：首先出現(xiàn)片狀帶往往是因為PCR體系中DNA酶過量、鎂離子濃度過高或者退火溫度低，循環(huán)次數(shù)等原因造成，需要挨個排查，退火溫度可以通過設置退火溫度梯度去摸索其條件，往往需要提高退火溫度，PCR體系的問題可以適當減少PCR體系中酶、鎂離子的用量。循環(huán)次數(shù)可以適當減少也可以避免一些情況。這些條件都需要摸索。此外，也可能是DNA電泳的瓊脂糖凝膠問題，需仔細排查。

4.如何判斷假陰性或假陽性？
答：PCR實驗中，假陽性的發(fā)生率比假陰性的發(fā)生率要低，這是因為往往PCR引物設計時候是特異性高的引物，往往可以根據(jù)擴增條帶在DNA電泳下的條帶大小進行產(chǎn)物長度的判定來驗證，此外，排除假陽性的結果往往都是擴增產(chǎn)物進行測序驗證可以進一步論證其結果可靠性。

假陰性的結果就比較復雜了，一般會設計一個陽性對照實驗，來排除PCR體系中試劑本身失效或者PCR儀器帶來影響，然后還需要檢查實驗過程所使用DNA模板的情況，一般NanoDrop或者Qubit核酸蛋白定量儀檢查模板質量和濃度。

5.如何確定設置的PCR的體系是正確的呢?
答：設置陽性對照往往是一個不錯的選擇，可以檢查PCR體系中試劑（比如酶的活性）是否能正常使用。此外引物與模板情況，如果嚴謹，可以檢查引物與模板的質量和濃度，再者就是一個合適的退火溫度，可以設置溫度梯度進行PCR，然后DNA電泳后觀察條帶情況來進行選擇合適的退火溫度。最后就是確定擴增產(chǎn)物的正確性，是DNA電泳判讀擴增條帶長度是否準確，其次是膠回收進行擴增產(chǎn)物的測序驗證。

6.如何確定引物的濃度？
答：這個需要根據(jù)情況，引物合成公司會首先提供每個引物的原始儲存濃度，然后根據(jù)其濃度加入雙蒸去離子水稀釋，稀釋成PCR體系使用的濃度，然后就是換算問題，一般引物合成公司會給一個度量指標是OD，一般來說會附帶一個說明書，一般1OD是5nmol，也就是說加入500uL水后就是10umol/L，根據(jù)PCR體系推薦的引物摩爾數(shù)，計算1uL引物加入也就是10pmol的量，這塊往往這個根據(jù)PCR試劑盒會有推薦引物濃度（根據(jù)PCR體系不同進行調整）。

7.PCR擴出來的條帶亮度很弱，如何排查原因呢？
答：一般擴出來條帶是正確大小長度下還是很弱的亮度的話，往往是擴增效率不高，這個可以首先加入陽性對照，確保儀器和PCR試劑盒如酶是正常的。第二要考慮DNA模板的問題，先檢查模板質量和濃度，濃度過低條帶暗，濃度過高，PCR反應會受到抑制，擴增效率不高，還有DNA純度不高也會影響擴增效率。第三，退火溫度，這塊可以設置一個退火溫度梯度進行試驗，確定最佳退火溫度，最后，就是引物的問題，引物設計不太好，存在引物自身或引物間的互補配對情況。

8.如何設計引物，注意事項有哪些呢？
答：引物設計的原則非常多，需要考慮的因素很多，但是其最大的原則是特異性！

特異性：必須要保證引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補堿基同源。

長度：一般引物長度在15-30bp，有時候可能因特殊原因50bp也可。

GC含量：一般40%-60%。

堿基隨機分布：引物堿基序列分布盡量隨機，不要連續(xù)很多個相同堿基。

引物的二級結果應當避免：引物自身、或者兩個引物間，盡量不要有互補結構。

引物的3′端必須高度保守：引物3′端務必與模版完全匹配，特別是最后一個堿基。這樣DNA酶才能順利匹配模板DNA進行復制延伸。

引物的5′端可以進行修飾：可以加入酶切位點，標記熒光、生物素等，也可以設計引入突變位點等情況。

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