多通道成像的重要性
多色或多通道顯微成像在研究中常用于更好地描述疾病特征，以及更好地了解生物過程。例如在免疫腫瘤學(xué)中，有必要研究不同免疫細(xì)胞相對于關(guān)鍵生物標(biāo)記物的位置。在神經(jīng)科學(xué)中，了解神經(jīng)元突觸的復(fù)雜性通常需要研究多種蛋白質(zhì)。在研究連通性時，必須清楚識別不同類型的神經(jīng)元及其位置。

                   
（圖像： 成年大鼠腦。神經(jīng)元（Alexa Fluor488，綠色）、星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP，紅色）、細(xì)胞核（DAPI，藍(lán)色）。圖像由中國廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)科學(xué)研究所和神經(jīng)內(nèi)科徐恩教授提供。）

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多色活細(xì)胞成像的成功關(guān)鍵因素
活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)是了解動態(tài)過程的關(guān)鍵。這類實(shí)驗(yàn)使我們能夠觀察記錄活體狀態(tài)下的細(xì)胞，而不會可能因固定或終止不同活體過程而產(chǎn)生干擾性結(jié)果。在活細(xì)胞顯微成像中使用多通道方法可以同步觀察多個細(xì)胞結(jié)構(gòu)和過程，提供生理學(xué)方面更重要的結(jié)果，從而為測量數(shù)據(jù)增加相關(guān)信息。使用單個熒光團(tuán)的實(shí)驗(yàn)很常見，但是使用兩個或多個熒光探針對活細(xì)胞成像則增加了實(shí)驗(yàn)難度，實(shí)驗(yàn)人員必須仔細(xì)考慮幾個要點(diǎn)才能成功。

1. 選擇合適的熒光團(tuán)：使用兩個或多個熒光信號時，需要最大程度的減少其光譜重疊。
2. 在生理?xiàng)l件下成像
3. 成像方式：寬場顯微成像通常是活細(xì)胞成像的首選。目前最常用的寬場顯微成像技術(shù)使用 LED 光源和濾光片組。但是，濾光片的帶寬和切換速度會嚴(yán)重影響采集靈敏度和成像速度，進(jìn)而增加光毒性和遺漏活細(xì)胞的動態(tài)信息。
4. 活細(xì)胞成像新方法：高光譜拆分（hyperspectual unmixing）與相量分析（phasor analysis）

                
（插入視頻1，視頻：RPE 細(xì)胞分裂的 12 小時共聚焦延時視頻，細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá) eGFP-tubulin（青色）和 iRFP-Histone H2B（品紅色）。由美國巴爾的摩約翰霍普金斯醫(yī)學(xué)院荷蘭實(shí)驗(yàn)室 C. Gliech 提供。荷蘭實(shí)驗(yàn)室致力于研究各種控制染色體精確分布的分子機(jī)制，以及有絲分裂錯誤在人體健康和疾病中起到的作用。）

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FluoSync：一種快速而溫和的多色光譜拆分寬場熒光成像方法
FluoSync是一種使用單次曝光同時進(jìn)行多通道熒光成像的精簡方法。
傳統(tǒng)的熒光成像方法通常按順序?qū)γ總�通道成像，以減少熒光團(tuán)之間的串?dāng)_，或采用多光譜成像以及后續(xù)的線性拆分或基于相量的光譜拆分方法。這些方法都需要進(jìn)行繁瑣的手動調(diào)整或深入理解底層技術(shù)，或兩者都需要。徠卡顯微系統(tǒng)通過FluoSync引入了一種綜合方法，在消除復(fù)雜性的同時保留了快速溫和成像的優(yōu)點(diǎn)。FluoSync會捕捉整個可見光光譜中的光子，與窄帶寬濾光片相比，丟棄的信息更少；然后采用基于相量的混合拆分方法分離每個信號，實(shí)現(xiàn)可靠的通道分離。   

   
（通過比較發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)熒光成像方法相比，F(xiàn)luoSync采集速度更快的優(yōu)勢顯而易見。FluoSync捕捉受激發(fā)染料的全發(fā)射光譜，因此光子不會被浪費(fèi)，這使它成為敏感活體樣本弱光成像的理想探測技術(shù)）
FluoSync充分利用了基于相量的拆分與線性拆分混合方法的優(yōu)勢。相量分析用于相似光譜的快速聚類以及光譜去噪和線性拆分，能夠識別染料對每個聚類的單獨(dú)貢獻(xiàn)，甚至包括超過 3 種染料的情況。

 
（圖 3。左側(cè)所示為藍(lán)色、綠色和紅色熒光團(tuán)的三個單獨(dú)光譜。使用相量分析時，每個純光譜都落入相量空間中的特定空間，顏色在一個圓圈上表示，信號清晰度決定了與中心（中間面板）的距離。這些熒光團(tuán)的任意組合也將落入特定空間。圖中所示是三個熒光團(tuán)中的每一個與所有三個熒光團(tuán)的混合體的一種組合。由于任何可能的熒光團(tuán)組合也將落入“它們的”空間，因此可將光譜平均化以實(shí)現(xiàn)去噪。右側(cè)圖是一個例子，其中黑線表示平均值 ± 誤差（顯示為灰色區(qū)域）。降噪光譜表示所有貢獻(xiàn)熒光團(tuán)的總和，它很好地填充了曲線下方的面積）

強(qiáng)大的FluoSync，在捕捉顯微圖像信息上具有天生的優(yōu)勢：
可使用不同的熒光團(tuán)組合更加自由地進(jìn)行多通道成像： 您不再受限于使用與顯微鏡的固定濾光鏡組匹配的染料組合。
提升數(shù)據(jù)生成效率： 能同時采集所有事件而無需管理多組濾光鏡，從而加快了圖像采集過程，提高了對多孔板等大型樣本成像的效率，并且能夠捕捉活體樣本中的快速事件。
增強(qiáng)信心：使用混合光譜拆分方法意味著您無需再擔(dān)心串?dāng)_。
 
AI驅(qū)動的顯微圖像數(shù)據(jù)分析
圖像采集完成之后，如何進(jìn)行數(shù)據(jù)背后的信息挖掘又是一個老大難的問題。有數(shù)據(jù)指出，圖像采集和分析是研究人員提高工作效率的主要限制因素。 最好的辦法是使用人工智能和機(jī)器學(xué)習(xí)來極大程度地改進(jìn)和加速圖像采集和分析的進(jìn)程。
  如果您希望對于“多色活細(xì)胞成像”有更多的了解，歡迎關(guān)注我們的系列網(wǎng)絡(luò)研討會：
 
第一場（英文）：
Leica New Imaging Technology——Get ready to enter the Microhub era
2021年3月4日  周五 | 北京時間10:00am
 
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第二場（中文）：
徠卡顯微成像新技術(shù)——歡迎進(jìn)入多色同時成像新紀(jì)元
2021年3月14日 周一 | 北京時間 10:00am

10:00-10:45	Get ready to enter the Microhub era（中文字幕）
10:45-11:00	徠卡多模態(tài)顯微成像分析中樞介紹（主講人：趙夢路）

 
 
  趙夢路
徠卡生命科學(xué)顯微鏡應(yīng)用專家
 
2017畢業(yè)于中國藥科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與分子影像實(shí)驗(yàn)室，主要研究腫瘤標(biāo)志物配體親和力，腫瘤靶向探針熒光成像、近紅外成像。加入徠卡后主要負(fù)責(zé)超高分辨顯微鏡STED，F(xiàn)LIM熒光壽命檢測，高端共聚焦FRAP FRET技術(shù)支持工作。同時在高端寬場顯微鏡THUNDER、TIRF、Scanner、激光顯微切割技術(shù)方面有豐富經(jīng)驗(yàn)。 
 
 
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