眾所周知，熒光壽命成像需要脈沖式的激光光源。徠卡首創(chuàng)白激光Lightgate門控技術(shù)，白激光（WhiteLight Laser）是從470nm到670nm激發(fā)譜線自由可調(diào)的激光光源，同時(shí)又是一個(gè)脈沖式的激光光源，其脈沖頻率正好適合于常規(guī)染料的熒光壽命成像。徠卡HyD混合型檢測(cè)器具有靈敏度高、背景噪音低、動(dòng)態(tài)范圍大、讀取速度快等特性。徠卡HyD與白激光整合后，即可實(shí)現(xiàn)時(shí)間門控（gating）成像，在白激光的兩個(gè)脈沖激發(fā)之間，HyD檢測(cè)器的時(shí)間窗口自由可調(diào)，可從時(shí)間維度來(lái)避開(kāi)自發(fā)熒光、激光反射光和雜散光等信號(hào)的干擾。

搭載白激光的徠卡TCS SP8 X 共聚焦顯微鏡

擁有 Leica TCS SP8 X 可以調(diào)節(jié)激發(fā)光與熒光染料精確匹配，降低使用激光能量，并且提高細(xì)胞活性。激發(fā)和檢測(cè)光譜的自由調(diào)節(jié)使采集復(fù)雜的激發(fā)-發(fā)射光譜成為可能。有了光譜信息，任何染料都可以實(shí)現(xiàn)最少光譜交叉、最少樣品損害的最佳激發(fā)。可同時(shí)使用最多8條激發(fā)譜線。

 

為了檢測(cè)Lightgate在熒光成像中去除葉綠體自發(fā)熒光的影響，Kodama Y.使用配備白激光和HyD檢測(cè)器的Leica TCS SP8 X對(duì)M. polymorpha植株中的熒光標(biāo)記進(jìn)行了對(duì)比鑒定。Lightgate能很好地去除葉綠素在黃色和綠色波段的自發(fā)熒光干擾，僅需延后0.1ns即可在綠色波段去除絕大部分自發(fā)熒光的串?dāng)_。

Lightgate能去除葉綠素在黃色和綠色波段的自發(fā)熒光干擾

Lightgate檢測(cè)起始時(shí)間對(duì)去除自發(fā)熒光程度的影響。僅需延后0.1ns開(kāi)始門控檢測(cè)，即可去除絕大部分自發(fā)熒光信號(hào)。

由于總的檢測(cè)時(shí)間窗口縮小，打開(kāi)Lightgate時(shí)間門控之后，人工標(biāo)記熒光的亮度會(huì)稍微有所下降，但是下降幅度很小。由于使用了高靈敏度的HyD檢測(cè)器，Lightgate門控導(dǎo)致的亮度下降對(duì)正常成像幾乎完全沒(méi)有影響。

打開(kāi)Lightgate時(shí)間門控對(duì)在根細(xì)胞中Citrine黃色熒光信號(hào)的影響

自發(fā)熒光的干擾成為植物學(xué)成像的一大瓶頸，使得對(duì)生理狀態(tài)下的組織和細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)追蹤等應(yīng)用變得異常困難。在各種去除自發(fā)熒光的各種方法中，徠卡白激光的Lightgate時(shí)間門控技術(shù)是目前最快捷而有效的一種方法，在去除自發(fā)熒光和雜散光的同時(shí)，又能保存下絕大部分真實(shí)的熒光信號(hào)，同時(shí)可應(yīng)用于z-stack、時(shí)間序列等各種成像方式中，使得在植株水平進(jìn)行多色熒光多維成像變得更加輕松自如。

本文中圖1-圖5中使用的擬南芥（Arabidopsis thalinana）材料為綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）定位在線粒體β-ATPase亞基上的43A9株系14天幼苗，材料由中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院姚楠實(shí)驗(yàn)室提供，特此感謝！